拟南芥Rab1家族基因的克隆和功能研究

Yptl蛋白是酵母唯一的Rab1 GTP酶,调控囊泡从内质网到高尔基体的运输.酵母温敏突变株 ASY01是一个Ypt1基因功能部分缺失菌株,在26℃可以正常生长,但在37℃不能生长.拟南芥有4个Rab1基因,分别是AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、AtRab1C1.克隆了所有4个AtRab1基因,构建酵母表达载体,转化温敏突变型酵母ASY01.温度敏感性实验结果表明,所有转基因菌株在37℃都恢复正常生长.说明拟南芥4个Rab1基因都与酵母Ypt1基因功能互补,都具有调节囊泡从内质网到高尔基体运输的功能.     

一个新的人Rb26基因cDNA的克隆、表达及其增强细胞吞噬功能研究

Rab GTPase家族成员基因及其调节囊泡膜运输途径功能已有许多报道,但Rab26蛋白分子的结构和功能仍不清晰.通过生物信息学分析,并在人脑cDNA文库中克隆了一个新的Rab26基因全长cDNA序列,长1 656bp,与已发表的基因序列相比,在48～50位插入了GCC,在956位T被C取代,而在1 197位G被A取代.该序列包含一个771 bp完整的开放阅读框(ORE),编码256个氨基酸残基的Rab26蛋白,分子质量为27.9 ku(GenBank登录号No.AY646153),而非如以往报告的190个氨基酸残基.GFP荧光标记全长Rb26在哺乳动物细胞中表达显示,Rab26主要呈现在细胞膜状结构相联系的分布,发现该基因高表达能显著增强PE标记的红色异源蛋白质的吞噬.还应用逆转录.聚合酶链反应对多种人肿瘤细胞Rb26表达进行了研究,结果显示,Rab26在Acc2、SPC-A1,K562以及HeLa等肿瘤细胞株呈高表达,而在SMMOL/LC-7721、HepG2、Caco2等肝和肠上皮细胞株中则不表达,值得进一步深入研究.     

香蕉MaNHX5关键耐盐氨基酸位点的鉴定及验证

为提高香蕉NHX基因的耐盐性,从巴西蕉(Musa acuminata L. AAA group)中克隆到一个MaNHXs基因家族的MaNHX5基因,利用生物信息学方法预测了Ma NHX5关键耐盐氨基酸位点和突变前后蛋白质结构的变化,通过定点突变技术将Ma NHX5蛋白的276位丝氨酸(S)成功突变为天冬氨酸(D),利用AXT3盐敏感突变酵母进行功能回补试验。结果表明,将突变后的MaNHX5基因转入AXT3盐敏感突变酵母,200 mmol/L NaCl处理下,突变酵母耐盐性显著提高。由此推测Ma NHX5蛋白的Ser276对香蕉Na+跨液泡膜运输起重要作用。     

巴斯德毕赤酵母Orm1蛋白在细胞生长和内质网功能维持方面的功能

【目的】鉴定巴斯德毕赤酵母ORM1基因;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长、内质网压力应答、细胞钙稳态调节和活性氧水平等方面的影响。【方法】利用生物信息学软件对毕赤酵母Orm1蛋白进行序列比对和分析;利用PCR介导的同源重组法构建orm1Δ缺失菌株,将回补质粒p IB1-ORM1转入orm1Δ菌株构建回补菌株;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长的影响;以Fluo-3 AM染色法测定胞质钙含量;以DCFH-DA染色法分析胞内活性氧水平;以实时荧光定量PCR技术研究ORM1基因缺失对毕赤酵母非折叠蛋白应答、钙稳态和抗氧化系统基因表达的影响;使用试剂盒分析毕赤酵母抗氧化系统过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)的含量。【结果】在毕赤酵母基因组数据库中比对出酿酒酵母Orm1和Orm2的同源蛋白,并将该蛋白编码基因命名为ORM1;毕赤酵母ORM1基因缺失导致细胞生长受到明显抑制,对衣霉素引起的内质网压力敏感性增强,非折叠蛋白应答激活,细胞钙稳态紊乱,活性氧积累,抗氧化系统激活。【结论】由于非折叠蛋白应答、钙稳态调节、活性氧积累等均与内质网功能息息相关,因此,巴斯德毕赤酵母ORM1基因编码的Orm1蛋白在细胞生长及内质网正常功能的维持过程中发挥重要作用。     

种子贮藏蛋白的运输、积累和基因表达调控

种子中贮藏蛋白的运输和积累途径主要有：(1)蛋白质合成后经内膜系统转移到蛋白质贮藏液泡(PSV)中积累;(2)合成的蛋白质直接在粗糙内质网的膜囊中积累形成蛋白质体;(3)贮藏蛋白不经高尔基体的加工由粗糙内质网上合成后直接运输到PSV中积累。贮藏蛋白基因的表达受该基因的顺式作用元件和反式作用因子的共同调控,此外染色体的结构也影响贮藏蛋白基因的表达。     

Caspase-1介导的蛋白质分泌机制新进展

此前多数观点认为内质网一高尔基体运输是经典的分泌型蛋白质分泌出胞的途径。它们要先翻译出一段信号肽,这段信号肽将mRNA连同核糖体转移到内质网上并使合成的蛋白质保存于内质网内,而后通过高尔基体分泌出胞。     

酵母Ndi1p突变表达文库的建立和温度敏感株的筛选

Ndi1p(internal NADH脱氢酶)是酵母线粒体电子传递链的重要组成部分,参与酵母线粒体呼吸、凋亡等多种生理活动. 本文成功建立了酵母Ndi1p突变表达文库, 随机测序表明,每个基因平均含有2个突变. 利用本文库进行了Ndi1p温度敏感突变筛选, 获得了一定数量的温度敏感型菌株, 并对温度敏感机理做了简单探索. 结果表 明,温度敏感酵母在需要Ndi1p脱氢酶活性的培养基上对温度敏感;有趣的是,这些温度敏感株细胞如果在30 ℃生长但在37 ℃测试不表现出温度敏感性,这暗示高温影响温度敏感Ndi1p的生成, 正常温度下Ndi1p正确构象一旦生成则高温不能引起Ndi1p变性. Ndi1p突变表达文库的建立对于Ndi1p参与的细胞呼吸、凋亡等过程的机理研究将有一定意义.     

Rab11的结构特征、效应因子与功能

Rab11是Rab小分子GTP酶家族的成员.在细胞内膜泡再循环途径中,Rab11作为重要调节因子,介导膜泡从内体向质膜的运输.近年来随着对Rab11研究的深入,人们发现该蛋白质在多种细胞生命活动中发挥着关键作用.现对Rab11的结构、效应蛋白及功能等方面进行了综述.     

囊泡运输的分子细胞机制

内膜系统构成了细胞及细胞器之间的天然屏障,保证重要的生命活动在相对独立的空间内进行。细胞内膜性细胞器之间的物质(如蛋白质、脂类)的运输主要是通过囊泡完成的。囊泡运输需要货物分子、运输复合体、动力蛋白和微管等的参与以及多种分子的调节,包括出芽、锚定和融合等过程。从上世纪60年代开始,人们认识到细胞分泌的蛋白需要先进入内质网,再到高尔基体,然后分泌到其作用部位。之后,信号肽假说被提出和证明。随后的研究完善了囊泡运输的过程,包括经内质网到高尔基体的蛋白质分泌运输过程中关键的调控基因及其作用环节、蛋白质复合物SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白附着蛋白受体)在囊泡锚定和融合中的作用机制等。在囊泡运输中的具有代表性的神经细胞突触囊泡中,触发突触囊泡融合的钙感受器(synaptotagmin)能快速准确地将钙信号传递到突触囊泡,通过与SNARE复合体等作用,实现与细胞膜融合并释放神经递质,最终完成神经信息的传递。该文从囊泡运输的研究历史回顾、已有研究成果以及未来展望等三个方面对囊泡运输分子细胞机制进行了阐述。     

Rab4：细胞囊泡循环运输过程的重要因子

囊泡运输是真核细胞中物质运输及信息交流的重要形式,Rab蛋白在这个过程中发挥着重要功能.Rab4是Rab蛋白家族的成员之一,参与调控早期内体的分选与内体循环途径.Rab4包括Rab4A、Rab4B和Rab4C 3个亚型.本文主要阐述了Rab4的结构特征、主要的效应蛋白和参与运输的货物蛋白以及影响细胞自噬、葡萄糖摄取、神经调节、心脏功能及肿瘤发生方面的功能.     

NPC1L1:固醇脂质吸收的关键蛋白质

NPC1L1是最近发现的一种与NPC1同源的蛋白质。在体内的分布有物种差异性,其亚细胞定位存在很大争议。近些年发现NPC1L1在固醇类脂质代谢途径中起着重要作用,是肠道吸收固醇类脂质尤其是胆固醇的关键蛋白质,这项新发现使得人们对固醇类脂质的吸收机制有了了解。高胆固醇血症是心血管系统疾病的一个高危因子,因此,对NPC1L1的研究具有重大的实际意义,正逐渐成为研究的热点。     

Stoichiometry studies reveal functional properties of KDC1 in plant shaker potassium channels

Functional heteromeric plant Shaker potassium channels can be formed by the assembly of subunits from different tissues, as well as from diverse plant species. KDC1 (K(+) Daucus carota 1) produces inward-rectifying currents in Xenopus oocytes when coexpressed with KAT1 and other subunits appertaining to different plant Shaker subfamilies. Owing to the presence of KDC1, resulting heteromeric channels display slower activation kinetics, a shift of the activation threshold toward more negative membrane potentials and current potentiation upon the addition of external zinc. Despite available information on heteromerization of plant Shaker channels, very little is known to date on the properties of the various stoichiometric configurations formed by different subunits. To investigate the functional properties of heteromeric nKDC1/mKAT1 configurations, we realized a series of dimeric constructs combining KDC1 and KAT1 alpha-subunits. We found that homomeric channels, formed by monomeric or dimeric alpha-subunit constructs, show identical biophysical characteristics. Coinjections of diverse tandem constructs, instead, displayed significantly different currents proving that KDC1 has high affinity for KAT1 and participates in the formation of functional channels with at most two KDC1 subunits, whereas three KDC1 subunits prevented the formation of functional channels. This article brings a contribution to the understanding of the molecular mechanisms regulating plant Shaker channel functionality by association of modulatory subunits.     

Variation in salinity tolerance and shoot sodium accumulation in Arabidopsis ecotypes linked to differences in the natural expression levels of transporters involved in sodium transport

Salinity tolerance can be attributed to three different mechanisms: Na⁺ exclusion from the shoot, Na⁺ tissue tolerance and osmotic tolerance. Although several key ion channels and transporters involved in these processes are known, the variation in expression profiles and the effects of these proteins on Na⁺ transport in different accessions of the same species are unknown. Here, expression profiles of the genes AtHKT1;1, AtSOS1, AtNHX1 and AtAVP1 are determined in four ecotypes of Arabidopsis thaliana. Not only are these genes differentially regulated between ecotypes, the expression levels of the genes can be linked to the concentration of Na⁺ in the plant. An inverse relationship was found between AtSOS1 expression in the root and total plant Na⁺ accumulation, supporting a role for AtSOS1 in Na⁺ efflux from the plant. Similarly, ecotypes with high expression levels of AtHKT1;1 in the root had lower shoot Na⁺ concentrations, due to the hypothesized role of AtHKT1;1 in retrieval of Na⁺ from the transpiration stream. The inverse relationship between shoot Na⁺ concentration and salinity tolerance typical of most cereal crop plants was not demonstrated, but a positive relationship was found between salt tolerance and levels of AtAVP1 expression, which may be related to tissue tolerance.     

Carboxamide SIRT1 inhibitors block DBC1 binding via an acetylation-independent mechanism

SIRT1 is an NAD⁺-dependent deacetylase that counteracts multiple disease states associated with aging and may underlie some of the health benefits of calorie restriction. Understanding how SIRT1 is regulated in vivo could therefore lead to new strategies to treat age-related diseases. SIRT1 forms a stable complex with DBC1, an endogenous inhibitor. Little is known regarding the biochemical nature of SIRT1-DBC1 complex formation, how it is regulated and whether or not it is possible to block this interaction pharmacologically. In this study, we show that critical residues within the catalytic core of SIRT1 mediate binding to DBC1 via its N-terminal region, and that several carboxamide SIRT1 inhibitors, including EX-527, can completely block this interaction. We identify two acetylation sites on DBC1 that regulate its ability to bind SIRT1 and suppress its activity. Furthermore, we show that DBC1 itself is a substrate for SIRT1. Surprisingly, the effect of EX-527 on SIRT1-DBC1 binding is independent of DBC1 acetylation. Together, these data show that protein acetylation serves as an endogenous regulatory mechanism for SIRT1-DBC1 binding and illuminate a new path to developing small-molecule modulators of SIRT1.     

人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Notch通路信号分子表达的变化

本研究探讨Noah信号通路在人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）体外增殖及向神经细胞分化过程中的作用。采集健康自愿者骨髓,体外培养获得hMSCs,取第3代hMSCs,在诱导剂（β-ME,DMSO,BHA）作用下向神经细胞分化。诱导后用免疫细胞化学鉴定神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）和尼氏体的表达以确定诱导效果：用流式细胞术检测细胞生长周期时相的变化。在诱导前后,用免疫荧光和RT-PCR方法检测Notch通路中Notch1受体蛋白、配体Jagged1（JAG1）、调节蛋白活化相关物早老素1（presenilin 1,PS1）、靶基因hairy and enhancer of split1（HES1）信号分子表达的变化。结果显示：诱导前,处于G0/G1期的hMSCs占58．5％,S＋G2/M期的细胞占41．5％;诱导后,G0/G1期细胞比例升高,而S＋G2/M期细胞比例下降,NSE阳性细胞率达（77±0．35）％,细胞质中可见深蓝色的块状或颗粒状尼氏体。免疫荧光显示,诱导前后hMSCs内Notch1和JAG1均呈阳性表达,但RT-PCR检测发现诱导后Notch1、JAG1、PSl和HES1 mRNA表达量较诱导前明显降低（均P〈0．05）。结果表明,诱导hMSCs向神经细胞分化能抑制Notch信号分子表达,低水平的Notch信号激活可能有利于神经细胞的分化。     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

一个中国Gilbert综合征家系的遗传学分析

对一个中国汉族Gilbert综合征遗传家系致病基因突变位点进行鉴定,以期了解该病的分子遗传学基础。首先提取先证者基因组DNA,PCR扩增尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1基因的5个外显子,以琼脂糖电泳鉴定PCR产物,纯化后直接测序鉴定。基因扫描显示,与血清胆红素水平密切相关的UGT1A1基因在第1和第5外显子存在纯合突变,而 UGT1A1基因启动子区域和内含子/外显子剪接边界位点序列未检测到突变。进一步对其他家系成员该基因的相应位点进行突变检测,结果显示他们在第1和第5外显子也存在杂合突变,其中还有两个成员在启动子区域检测到(TA)插入突变。对家系成员未抗凝新鲜血液进行生化检测证实了基因突变分析的结果。综合以上结果发现该家系三种突变并存,致病因素为第1和/或第5外显子突变,为显性遗传,两种突变位点纯合导致先证者出现严重胆红素代谢功能障碍。该家系因此成为Gilbert综合征突变位点及其致病机理研究的一个典型临床病例。     

细胞色素P450 1A1基因多态性与我国某些肿瘤遗传易感性

近年来有关细胞色素P450基因多态性与肿瘤遗传易感性的研究正日益吸引越来越多的关注,本文对我国近年来有关细胞色素P450 1A1(CYP1Al)基因多态性与几种肿瘤遗传易感性的研究进行探讨,推测我国几种高发病率肿瘤的发生与我国CYP1A1基因多态分布状况有关,以此为进一步研究CYP1A1与肿瘤的关系作参考。