以“dominant negative”策略消除人肝癌细胞表？…

选用高表达α６β１并主要借其介导细胞在层粘连蛋白（ｌａｍｉｎｉｎ,ＬＮ）基质上粘附和铺展的肝癌细胞系Ｂｅｌ７４０２,采用“ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ”策略消除细胞表面α６β１受体的功能,以研究α６β１在人肝癌细胞生物学行为中的作用。用缺失胞质功能域的β４亚单位ｃＤＮＡ（β４－ｔｒ）转染细胞,其表达产物β４－ＴＲ可以和α６高亲和性竞争性地结合,形成因β４－ＴＲ缺失胞质功能域而无生物学功能的     

整合素α6亚单位和肿瘤的发生、发展与转移

整合素为跨膜糖蛋白,属于细胞表面的粘附分子。胞外域介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质间的识别与结合,胞质域与细胞骨架和信号转导系统相连。α6亚单位与β1或β4亚单位非共价结合形成异二聚体,是细胞外基质蛋白质——层粘连蛋白的单特异性受体,与肿瘤的发生、发展和转移有着非常密切的关系。多种肿瘤的发生伴有整合素α6表达水平的变化,包括表达水平的升高、降低或极性分布的变化。表现为一些不表达α6β1的细胞,如肝细胞癌变后通过新合成的α6β1介导了肿瘤细胞与基底膜间相互作用而促进了肿瘤细胞的转移;表达α6β1的细胞α6β1失去沿基底膜的极性分布,导致细胞与基底膜的结合减弱,癌细胞易于脱落而发生转移;还可以通过促进细胞基质金属蛋白酶的分泌而促进肿瘤的转移,并导致肿瘤细胞的低分化表型。整合素α6可以促进肿瘤新生脉管的生成,一方面增加瘤组织的血供和营养,促进肿瘤的生长;另一方面促进脱落的肿瘤细胞进入血循环发生转移。     

整合蛋白α5β1过表达诱导人肝癌细胞SMMC-7721“失巢凋亡”机理

为了进一步阐明整合蛋白α5 β1过表达诱导非粘着状态的人肝癌细胞SMMC 772 1失巢凋亡的机理 ,利用poly HEME阻断细胞贴壁 ,诱导失巢凋亡 ,在poly HEME包被的 96孔板中检测细胞生存率 .利用Western印迹法检测了与细胞信号转导密切相关的粘着斑激酶 (FAK)、蛋白激酶B(PKB)及生存蛋白survivin的表达水平 .α5 β1过表达细胞株在去粘附状态下的生存率明显低于对照细胞 .在生长 8d时 ,以整合蛋白不同亚单位转染的α5 β1 772 1、β1 772 1和α5 772 1细胞 ,活细胞数分别降至对照组的 4 0 %、4 5 %和 83% .这说明整合蛋白α5 β1过表达细胞株 ,特别是α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的失巢凋亡明显加快 .细胞悬浮生长 2 4h后 ,α5 β1过表达细胞株都有不同程度的凋亡发生 ;同时粘着斑激酶 (FAK)和蛋白激酶B(PKB)表达量及其磷酸化水平均低于对照细胞 ,而survivin表达水平在α5 β1 772 1中最高 ,在 β1 772 1中最低 .在给予天然细胞外基质纤粘连蛋白的条件下 ,α5 β1 772 1和 β1 772 1细胞的FAK和PKB的磷酸化水平却呈升高趋势 .结果说明 ,FAK和PKB的变化与细胞的粘附状态密切相关 ,并且参与整合蛋白α5 β1过表达细胞在去粘附状态下失巢凋亡的发生 .     

整合素及其在胚泡植入中的作用

整合素是一类由α、β亚基构成的异二聚体粘附分子,能够与胶原蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白等细胞外基质组分相互作用,调节细胞粘附和通讯.作为双向传递分子,整合素通过“胞内→胞外”和“胞外→胞内”两种方式介导细胞信号传递.成功的植入是侵入性的胚泡和接受性的子宫内膜相互作用的结果,整合素能够调节胚泡滋养层与子宫内膜之间的细胞-细胞及细胞-细胞外基质相互作用,是“植入窗口”期子宫内膜接受性的标记分子.     

重组人维甲酸X受体α的克隆与表达及其与甲状腺受体的结合

维甲酸X受体α(Retinoid X receptor-α,RXR-α)属于核受体家族,在调节基因转录及信号转导方面发挥着重要的作用。为了深入研究RXR-α的生物学作用,文章利用RT-PCR技术扩增了人RXR-α基因,并将其克隆入原核表达载体pQE-30Xa,转化大肠杆菌M15[PREP4],异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE可见与预期大小相符的蛋白条带,Western blotting证实该条带为重组人RXR-α蛋白,并用Ni2-NTA柱进行亲和层析纯化。免疫共沉淀结果显示其具有与TRβ1结合的能力。电泳迁移率改变实验(EMSA)显示RXR-α与TRβ1形成的杂二聚体具有与DNA结合的能力。结果显示,文章已成功建立了重组人RXR-α的大肠杆菌表达系统,表达产物具有很好的生物学活性。     

NGX6基因抑制高转移鼻咽癌细胞的侵袭运动能力

 NGX6 基因是我室利用定位候选克隆策略,在鼻咽癌的高频杂合性缺失区9p21-22克隆的新基因.前期研究结果提示,它与鼻咽癌细胞的侵袭转移密切相关.为了进一步阐明其作用的结构基础,本研究成功构建了含NGX6基因及突变体的pCMV-myc瞬时和pcDNA3.1-his-myc(-)B稳定表达载体.通过脂质体转染技术,构建了NGX6及突变体的稳定表达细胞系5-8F.用免疫荧光试验和免疫电镜观察了NGX6在5-8F细胞中的亚细胞定位主要位于胞膜、核膜以及胞浆中的膜质结构,缺失突变的功能域对其定位没有明显的影响.基质胶侵袭试验和划痕试验研究了NGX6及突变体对细胞运动的影响.NGX6能抑制高转移潜能的鼻咽癌细胞5-8F的运动和侵袭能力,缺失胞内区（CYTO）后NGX6不能抑制5-8F细胞的运动和侵袭,提示CYTO可能是其发挥作用的重要功能域.     

金属硫蛋白及其结构域突变体的紫外和圆二色光谱学研究

采用 p GEX- 4T- 1融合表达载体高效表达所得的金属硫蛋白及其结构域突变体 ,包括 α结构域 ,β结构域 ,α- KKS- α和 β- KKS- β( KKS为金属硫蛋白结构域之间的天然连接区氨基酸 ) ,经纯化和纯度鉴定后 ,利用紫外和圆二色光谱进行结构研究 .在脱金属的上述蛋白中 ,固定 p H为中性 ,改变加入 Cd2 + 的比例 ,或固定 Cd2 + 浓度 ,逐渐调节 p H至中性 ,观察紫外和圆二色光谱中镉硫金属簇吸收峰的形成 .研究结果表明 :镉硫金属簇的形成依赖于加入金属的比例和 p H值 ,所有蛋白均于p H3.1 5以上开始形成明显的吸收峰 .紫外图谱中的吸收峰位于 2 54nm附近 ,但在圆二色图谱中不同蛋白形成的峰的位置不同 ,MT,α结构域和 α- KKS- α在 2 2 5nm和 2 58nm处有吸收 ,β结构域在 2 60 nm处有吸收 ,而 β- KKS- β在 2 4 5nm处有吸收 ;向 α结构域 ,β结构域 ,MT,α- KKS- α和 β-KKS- β中分别加入 4eq,3eq,7eq,8eq和 6eq( eq:equivalent,当量 )的 Cd2 +时 ,吸收峰可达到最大值 .同时发现 α结构域的吸收峰强于 β结构域 ,而且双结构域突变体的镉硫金属簇则明显强于相应的单结构域突变体 ,这表明吸收峰的强弱与金属结合力的大小相关 ,而且结构域之间存在相互作用 ,从而影响与金属的结合 .     

三裂蟛蜞菊中的倍半萜内酯成分及其化感作用

从外来种三裂蟛蜞菊(Wedelia trilobata)的全株中分离得到6个倍半萜内酯化合物,通过光谱分析,分别鉴定为6-异丁酰基-三叶拉色芹内酯(1)、1 β-acetoxy-4α,9α-dihydroxy-6 β-isobutyroxyprostatolide(2)、1 β,9α-diacetoxy-4α-hydroxy-6 β-isobutyroxyprostatolide(3a)、1 β,9α-diacetoxy-4α-hydroxy-6β-methacryl-oxyprostatolide(3b)、1 β,4α-dihydroxy-9α-tigloyloxy-6β-methylpropanoylprostatolide（4a)、9α-angeloyloxy-1 β,4α-dihydroxy-6 β-methylpro-panoylprostatolide(4b)。除1和3a外,其余4个化合物均是首次从该植物中得到。通过种子萌发和幼苗生长抑制试验发现化合物1、2、3a和3b的混合物以及4a和4b的混合物对萝卜、小白菜和西红柿的幼苗生长有较强的抑制作用。4a和4b的混合物对咸水虾有较高的毒性。     

PTEN对SMMC—7721人肝癌细胞迁移增殖及粘着斑激酶磷酸化水平的影响

抑癌基因PTEN编码产物具有双专一性磷酸酶活性 ,并与细胞骨架张力蛋白同源。PTEN可参与粘着斑的形成和解聚而影响细胞迁移。现用PTEN表达质粒转染SMMC 772 1肝癌细胞 ,研究SMMC 772 1细胞运动能力的变化及PTEN与粘着斑激酶 (FAK)酪氨酸磷酸化水平之间的关系。PTEN过表达能够显著抑制细胞在Fn基质上的活动 :细胞在Fn基质上的迁移下降了 35 % ;在 30min和 6 0min两个时间点 ,Fn基质上细胞铺展分别降低了 2 9%和 2 6 % ;而在多聚赖氨酸基质上细胞铺展并没有变化。运用免疫沉淀和Western印迹方法 ,分析FAK及其酪氨酸磷酸化水平 ,发现PTEN过表达不影响FAK表达 ,但显著降低Fn诱导的FAK酪氨酸磷酸化水平 ,两者水平呈负相关。流式细胞仪分析细胞周期结果表明 ,PTEN抑制细胞 ,S期细胞下降了 16 %。上述结果提示 ,PTEN抑制肝癌细胞迁移铺展和增殖 ;PTEN对细胞运动的影响可能通过调节FAK酪氨酸磷酸化水平而实现。     

层粘连蛋白促进实体型瘤细胞粘着、铺展及~3H-TdR参人

 恶性肿瘤细胞或粘着于基膜以及在一定的基质上增殖对于肿瘤的浸润转移至关重要。层粘连蛋白(1aminin,LN)是基膜所特有的非胶原糖蛋白。我们研究了LN在肿瘤细胞粘着、铺展及增殖中的作用。通过测定粘着细胞所释放的LDH活性定量分析细胞粘着率。LN可显著增加体外培养的小鼠S180-V肉瘤及B16-MBK黑色素瘤细胞在玻璃及Ⅳ型胶原基质上粘着及铺展。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)亦有类似作用。而非糖蛋白(牛血清清蛋白)或其他糖蛋白(鸡卵清清蛋白或免疫球蛋白)均无类似作用。此外,LN或FN抗体可分别抑制细胞粘着于LN或FN。这些结果表明LN或FN促细胞粘着作用是专一性的。扫描电镜观察表明,粘着在LN敷盖的玻璃表面的瘤细胞呈多突扁平形、膜皱襞及微绒毛十分稀少,而粘着在裸露的玻璃表面者为球形,膜皱襞及微绒毛甚多。再者,~3H-TdR向粘着于LN基质上的瘤细胞群的参入量显著高于粘着在裸露玻璃面者。     

小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4的胞外肽段表达及纯化

目的: 真核细胞表达小鼠淋巴细胞抗原CTLA-4胞外段肽,研究表达肽段与抗原呈递细胞B7分子结合后减轻小鼠淋巴细胞刺激后的增殖抑制,从而启动T淋巴细胞进一步增殖。方法:从小鼠脾脏淋巴细胞获得总RNA,通过逆转录PCR扩增出CTLA-4全长基因,克隆并测序。依据胞外段序列和真核表达载体pcDNA3.1序列,合成引物扩增胞外片段,两者经内切核酸酶处理、连接构建重组表达pcDNA3.1载体,重组质粒经测序验证后,采用lipofectamine 2000转染入小鼠肝癌细胞Hepa1-6,经G418筛选获得稳定表达细胞株。结果:获得小鼠CTLA-4胞外段真核表达载体和小鼠肝癌细胞Hepa1-6稳定表达转染细胞株,制备了CTLA-4胞外肽段,经His标签抗体和小鼠CTLA-4抗体Western blot检测表达蛋白带均呈阳性。结论:获得CTLA-4胞外段肽,为进一步研究该肽的作用打下基础。     

整合素在细胞黏附中的生物学功能

整合素是一种跨膜蛋白,属于黏附分子家族.其主要功能是参与细胞和细胞、细胞和细胞外基质(ECM)的黏附和信号转导.整合素是含有α和β两条肽链的异源二聚体,来源不同的α、β亚基所形成的整合素具有不同的ECM结合能力.阐述了整合素的结构、生物学功能以及生理、病理学意义,并概述了其研究进展.     

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76 kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体 αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体 αS1-LA-psv 转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120 h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

转化生长因子-β对整合蛋白表达与活性的调节

转化生长因子 β(ＴＧＦ β)是一类多功能肽类生长因子 ,具有特异的受体及信号转导系统 ,在控制细胞生长、分化、凋亡等方面均起重要作用。已经发现ＴＧＦ β通过细胞内信号转导分子Ｓｍａｄｓ调控各种基因的表达 ,从而在控制细胞外基质蛋白及细胞表面整合蛋白的合成中起重要作用[1] 。整合蛋白是一类存在于细胞表面的跨膜粘附分子 ,主要介导细胞与细胞外基质 (ＥＣＭ)及细胞与细胞之间的粘附作用。整合蛋白由α和 β两种亚基以异源二聚体的形式组成二十余种不同的受体 ,现已证实在伤口愈合、炎症反应、血栓形成、肿瘤发生以及迁移等许多过…     

一种新的肝细胞生成素（HPO）转录本及其生物学活性

利用 5′RACE技术从人胎肝组织中分离一种新形式的肝细胞生成素 (HPO 2 0 5 )cDNA ,其编码蛋白质氨基酸序列的N端较已报道的人肝细胞生成素HPO(hepatopoietin)多 80个氨基酸 ,推测其蛋白质分子量为 2 3kD。RT PCR检测HPOmRNA在多种肝癌细胞中表达 ,Western印迹可检测到 2 3kDHPO 2 0 5表达 ,表明此种形式HPO在自然状态下存在。将构建的HPO 2 0 5真核表达载体转染入COS 7细胞 ,其表达蛋白质能够刺激HepG2肝癌细胞DNA合成 ;将HPO 2 0 5、HPO和荷空表达载体分别转染入低水平表达HPO的Bel 740 2肝癌细胞株 ,发现HPO 2 0 5比HPO具有较强的激活MAPK磷酸化的活性。细胞周期分析稳定转染HPO 2 0 5 ,HPO细胞的增殖周期也支持这一结论。这些结果表明HPO 2 0 5具有刺激肝源性细胞增殖的活性 ,并提示HPO 2 0 5可能较HPO有更强的生物学活性     

恒河猴胚胎浅表型植入机理的探讨

为揭示恒河猴胚胎浅表型植入的分子机理,实验采用免疫组化和原位杂交的方法研究了粘附侵润相关分子在妊娠恒河猴母胎界面的表达模式,发现层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在滋养层细胞柱的远端开始表达;整合素α1β1从柱的近端到远端表达逐渐升高,但在滋养层细胞鞘中上述分子的表达均降低;大量侵润母体血管的滋养层细胞高水平表达上述分子。此外,植入早期上皮斑和蜕膜基质细胞高表达MMPs组织抑制因子-2(TIMP-2)。结果提示,滋养层细胞鞘中α1β1、LN、MMP-2表达水平的降低及上皮斑、蜕膜和滋养层细胞中TIMP-2的高表达可能是导致浅表型植入形成的分子基础。     

肺泡型细胞内表皮生长因子和转化生长因子α、β_1及其受体基因表达的研究

分离培养成年大鼠的肺泡 型细胞 ,通过斑点杂交、原位杂交和免疫组织化学染色 ,研究肺泡 型细胞内表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子 α和 β1 (TGFα、TGFβ1 )及其受体基因的表达。结果显示肺泡 型细胞可表达 EGF、TGFα和TGFβ1 ,也可表达相应的 EGF受体 (EGFR)、TGFβ受体 型和 型 (TβR 、TβR )。表明肺泡 型细胞是合成和分泌 EGF、TGFα和 TGFβ1 的细胞之一 ;细胞凭借其 EGFR、TβR的存在 ,其增殖与分化可能受 EGF、TGFα和 TGFβ1 的旁分泌和自分泌两种途径调控。     

SDF—1α对单核细胞的黏附作用

目的探讨pcDNA3．1-基质细胞衍生因子1α重组质粒对单核细胞的黏附作用。方法将pcDNA3．1-2基质细胞衍生因子1α质粒用脂质体的方法导入人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞中,G418筛选细胞克隆。通过逆转录聚合酶链反应法在转录水平检测基质细胞衍生因子1α在转基因ECV304细胞中的表达。在6孔板上种植转染基质细胞衍生因子1α基因的ECV304细胞,加THP-1细胞37℃孵育30min,磷酸缓冲液轻洗3次,去除未黏附细胞,倒置显微镜下计数上、下、左、右、中5个视野,取其平均值得到每个视野黏附单核细胞数。结果获得了稳定表达基质细胞衍生因子1α基因的ECV304细胞克隆,pcDNA3．1-基质细胞衍生因子1n重组质粒对单核细胞具有黏附作用。结论基质细胞衍生因子1α对单核细胞具有明显黏附作用。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。     

Two New Sesquiterpenoid Glucosides from the Aerial Parts of Saussurea involucrate

Two new sesqulterpenoid glucosides, namely α-hydroxycostic acid 6-β-D-glucopyranoside （compound 1） and 11 βH-11,13-dlhydrodehydrocostuslactone 8α-O-（6＇-acetyl）-β-D-glucopyranoside （compound 2）, along with 11 known sesqulterpenoids （compounds 3-13） were isolated from the aerial parts of Saussurea involucrate （Kar. et Kir.） Sch.- BIp. The structures of the new sesquiterpenoid glucosides were established by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance and mass spectrometry analysis.