人胚肝发育过程中染色质组份的变化

从14-,17-,21-,27-,34-,及38-周令的人胚肝细胞核分离出柒色质,分别对其中的RNA、DNA、组蛋白(HP)及非组蛋白(NHP)进行测定。在胚胎发育过程中肝柒色质HP/DNA比值变化不大。但是,NHP/DNA与NHP/HP比值发生显著改变。人胚肝NHP量的变化一直保持在整个胚胎发育过程中,NHP量的高峰位于21-及34-周。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶板电泳分析处于不同发育阶段的人胚肝总染色质蛋白。电泳图谱显示出染色质NHP组分在质与量上有所改变。     

基因调控——非组蛋白染色体蛋白质的一种作用

真核细胞基因表达与否受核内非组蛋白染色体蛋白质(NHCP)的调控。核内非组蛋白染色体蛋白质约有450种甚或500种,起调控基因表达的仅是其中磷酸化了的那部分NHCP。在正常细胞转化为癌细胞时,可观察到NHCP的变化。NHCP调控基因表达的机理模式之一,可能是去除组蛋白的阻遏作用。     

癌变原理研究——Ⅰ.二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程及发育过程中肝细胞增殖酶和组织特异酶活性的变化及其相互关系

本实验以二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌为动物模型,结合病理形态学研究了细胞增殖与组织特异代谢关键性酶ACT 及OCT,CPS_1活性的相互改变及其与癌变的关系,同时作了鼠肝发育过程中酶活性变化的比较研究。(1)根据DENA 引癌过程中酶活性CPS_Ⅰ/ACT,OCT/ACT 及ACT/CPS_Ⅰ,ACT/OCT 相对比值的变化,以及病理形态观察结果,DENA 引癌过程大致可分为三个阶段:喂DENA6周以内为单纯性增生期。此时期酶活性相对比值的改变是可逆的,与再生肝相似。第6周以后至16周为癌变期。此时期出现肝细胞异型性增生及癌变病灶。酶活性相对比值的改变是不可逆的。16周到30周为癌变细胞发展成为肝细胞癌期。(2)癌变过程中(喂DENA6周以后),OCT 及CPS_Ⅰ活性持续降低,同时ACT 活性持续增高。肝癌结节中OCT 及CPS_Ⅰ活性约为正常肝的10～20%,ACT 活性约为正常肝的2倍。癌变过程中这两类酶活性的相互改变与发育过程中的情况正好相反。在发育过程中,胚胎肝内OCT 及GPS_Ⅰ活性较成年水平低,而ACT 活性则较高。新生后CPS_Ⅰ及OCT 活性升高,同时ACT 活性降低。(3)肝与肝癌上述酶可能是相同的。因为酶活性的最适pH 和在聚丙烯酰胺凝胶电泳图上的分布都是一致的。肝与肝癌OCT 及ACT 的K_m 相同而V_m 不同,说明癌变过程中酶活性的变化,主要是由于酶蛋白量的改变。此外,肝癌线粒体的蛋白量减少,但OCT 及CPS_Ⅰ的比活性(单位/毫克线粒体蛋白)仍较正常肝线粒体的低。(4)讨论了增生和分化与癌变的关系。初步认为,肝细胞的癌变是反分化(分化逆转)问题,和正常分化一样系由于基因表现的改变,不一定包含基因结构的改变。就与癌变有关的细胞增殖和分化的矛盾而言,细胞增殖及其有关酶活性的增高,可能是癌变发生的基础,而组织特异功能及其关键性酶活性的降低,可能与癌变的关系更为密切。因此癌变的发生,可能是由于在细胞分裂过程中致癌物使肝细胞特异功能基因的调节控制失常,从而引起增生代谢与特异代谢关键性酶活性不可逆的改变,使之失去肝细胞增殖与特异功能的正常平衡,而代之以不受控制的增生,最后形成癌细胞。     

外源性肝胞质RNA对人肝癌细胞的生物学作用及体内分布

从正常动物肝脏提取了以胞质RNA 为主的RNA,以聚丙烯酰胺电泳及对人体肝癌(7402)细胞的生物学作用证明,制品含有相当于7～18S 的不均一RNA,和具有mRNA 的模板活性以及对基因活动的调节控制活性。应用~(125)Ⅰ(及~(131)Ⅰ)标记的肝RNA 注入正常小鼠及肝内接种移植性肝癌的小鼠,从整体动物扫描及脏器比放射性分布,证明~(125)Ⅰ-RNA 优先进入肝及肝癌组织,~(125)Ⅰ-核苷酸(NT)则呈均匀分布。注射10～50微居里~(125)Ⅰ-RNA,15分钟后,细胞放射自显影显示,在肝及肝癌细胞中出现银颗粒的积聚。~(125)Ⅰ-NT 在同样条件下,肝及肝癌细胞中未见明显的银粒积聚,由此提示~(125)Ⅰ-RNA 可能有相当部分以一定的大分子形式进入肝及肝癌细胞。人肝癌(7402)细胞经正常鼠肝RNA 温育24小时后,以~(14)C-亮氨酸对血清白蛋白的参入证明,人体肝癌细胞不仅合成鼠血清白蛋白,并可显著促进人血清白蛋白的合成,高达未处理的肝癌细胞的3.6倍,由此说明我们所制备的肝RNA 不仅具有供体(鼠)肝的模板活性作用,同时具有调节宿主(人)肝癌细胞基因活动的作用。放线菌素D 可部分或全部阻断这种调控作用,但对模板作用影响较少,甚至可见有增强作用。肝RNA 制品中显示的模板和调控活性可能来自两类不同功能的RNA,对此作了讨论。无论是模板或调控作用,都可能促使肝癌细胞发生功能上的分化,反映出癌细胞表现型的改变。通过外源性正常肝RNA 的调控作用,纠正癌细胞基因活动的异常,从而导致向正常细胞表现型逆转,可能将为肝癌的防治提供新的途径。     

正常小鼠肝和腹水型肝癌细胞核内酸溶性蛋白质磷酸化的比较研究

染色质的组成成分,组蛋白和非组蛋白在特异的蛋白激酶作用下可以发生磷酸化修饰,组蛋白和非组蛋白的磷酸化和脱磷酸化可能在染色质的结构,基因表达以及DNA复制中起着重要的作用。本文比较是小鼠腹水型肝癌细胞核和正常小鼠肝细胞核内酸溶性蛋白质及其磷酸化的差异。正常小鼠肝细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱有一条明显可见的组蛋白H_1~0蛋白带,而对小鼠腹水型肝癌来说,此带极浅,但在腹水型肝癌细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱上可见到表观分子量约为68K的一条蛋白带,而正常小鼠肝未见此带。此外,从电泳胶片~(32)P放射自显影图谱可见腹水型肝癌组蛋白H_1,H_2A和非组蛋白带Ⅱ(MW43K),带Ⅲ(MW.67K)带Ⅳ(M.w.97K)磷酸化程度明显高于正常小鼠肝。     

肝纤维化肝组织中肾上腺素能受体的表达研究

目的探讨肝纤维化大鼠肝脏组织中交感神经递质受体表达的变化情况。方法应用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠慢性肝纤维化模型。23只Wistar大鼠随机分为正常对照组(N组)和肝纤维化模型组(M组)。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot方法检测肝脏组织中肾上腺素能受体mRNA及蛋白质的表达情况。结果肝纤维化大鼠肝脏组织中肾上腺素能受体mRNA和蛋白质表达均比正常组明显增加(P<0·01)。结论肝纤维化时,大鼠肝脏组织中肾上腺素能受体α1-AR和β2-AR表达增加,这可能是肝纤维化时交感神经促进肝纤维化发展的作用机制之一。     

正常肝信息核糖核酸的翻译和对离体肝癌细胞的逆转分化作用

正常肝信息核糖核酸是从肝聚核蛋白体抽提RNA,通过寡聚(dT)纤维素亲和层析制备。分离的正常肝mRNA在麦胚蛋白合成系统和爪蟾卵翻译系统检定,能够翻译白蛋白,由此证明是有生物学活性的。用正常肝mRNA在离体情况下对肝癌细胞进行逆转分化研究,发现:(1)小鼠正常肝mRNA能抑制小鼠腹水肝癌细胞核酸和蛋白质的合成;初步见到人的正常肝mRNA能轻度抑制人体肝癌细胞(BEL-7404)的生长。(2)相应的正常肝mRNA分别在小鼠腹水肝癌和人肝癌细胞诱导了白蛋白合成;在人体肝癌细胞内核蛋白体聚成聚核蛋白体。(3)人体肝癌细胞受刀豆凝集素(Con A)凝集的能力减弱,这种凝集特性的改变,可以维持至3次细胞传代。这些实验结果显示肝癌细胞并非固定不可改变的,在正常肝mRNA作用下能够向正常逆转分化;讨论了mRNA转化机理,认为可能是通过肝mRNA翻译的蛋白质或mRNA本身直接调节基因转录来实现的。     

中药肝复康干预肝星状细胞及肝组织的蛋白质组学分析

目的：本实验通过中药对肝星状细胞和肝组织蛋白质组的干预实验,从蛋白质组学角度进一步揭示肝纤维化的发病机制和中药的药理作用,为新药研制提供理论依据。方法：制备正常大鼠肝星状细胞、加入血小板衍生生长因子的肝星状细胞及加入肝复康药物血清和血小板衍生生长因子的肝星状细胞,分别设定为正常对照组、模型组及治疗组;同时分别将注射二甲基亚硝胺、肝复康的大鼠设定为模型组及治疗组,并将各组大鼠肝脏取出。分别提取以上各组的总蛋白质并进行等电聚焦电泳,随后进行SDS-PAGE电泳。凝胶染色后比对蛋白质斑点,找出上调和下调的蛋白质。结果：随着治疗时间的不断延长,HSC的蛋白质表达在不同时间有了不同变化。大鼠造模4周后,模型组与治疗组肝组织总蛋白质图谱存在着一定差异,部分蛋白质在两组中表现出不同的丰度。结论：肝纤维化的发生与多种蛋白质的作用有关。中药肝复康治疗肝纤维化是通过调节多个蛋白质表达产生的。     

肝特异性表达HCV5＇NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的.以2235A-1质粒为模板,通过PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段,用小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段取代pHCV-neo4质粒(含HCV5＇NCR调控荧光素酶基因)的CMV启动子,构建了一种白蛋白启动子启动转录的HCV5＇NCR调控荧光素酶表达质粒(pA1b-HCV).该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高,表明成功地构建了肝特异性表达的HCv5＇NCR调控荧光素酶表达质粒.该研究为建立肝特异性表达的HCV5＇NCR转基因小鼠模型奠定了基础,对评价HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义.     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

基于全场光学相干层析图像的人体肝组织癌变定量特征分析研究

利用实验室搭建的全场光学相干层析(FFOCT)系统对人体正常与癌变肝组织分别进行成像,获得了高分辨率的层析图像。针对人眼识别FFOCT图像时难以区分正常与早期癌变肝组织的问题,提取两者FFOCT图像的灰度特征并进行统计学分析,以实现在参数特征上区分两者的目的。结果表明,在正常与癌变肝组织初步提取的均值、方差和峰度等五个特征参数中,有四个显示出了明显的数值差异,可用于鉴别肝组织是否癌变。该研究结果为进一步研究如何利用FFOCT图像中所提取的特征参数作为判断实际临床诊断中生物组织癌变与否的诊断标准打下了基础。     

大鼠肝癌发生过程基因转录调控机理的研究 Ⅰ.与DNA重复顺序互补的RNA的比较

肝细胞癌变过程,除去在细胞形态和代谢活动方面发生变化外,而且还呈现出某些胚胎肝的表型,如甲胎蛋白和胚胎性同功酶谱等。这些胚胎性蛋白在肝癌细胞中的再现,可能是由于肝细胞基因表达的调控系统,在肝细胞癌变过程中发生了异常变化,以至使己分化成熟的成年肝细胞去分化,进而发展为恶变细胞。我们用二乙基亚硝胺(DENA)诱发大鼠肝癌,在肝癌发生过程中,观察基因调控失调,及其与肝癌发生的关系。首先,     

藏红花酸抗小鼠肝纤维化的实验研究

目的:通过观察藏红花酸对肝纤维化小鼠肝组织病理学改变及p38MAPK蛋白表达的影响,探讨其抗肝纤维化作用及可能的机制。方法:36只6周龄雄性昆明小鼠随机分为3组:藏红花酸组、模型组、正常组。除正常对照组外,其余两组小鼠给予30%四氯化碳橄榄油溶液腹腔注射,首次注射5 m L/Kg,以后每次3 m L/Kg,每3日1次,连续12周。同时藏红花酸组给予藏红花酸5mg/Kg灌胃,每日1次,连续12周。实验过程中,观察各组小鼠的一般状态。12周末处死小鼠,肝组织切片行HE、Masson染色,显微镜下观察病理改变,免疫组化检测小鼠肝组织p38MAPK蛋白的表达。结果:实验过程中,模型组小鼠一般状态较差,体重增长缓慢;藏红花酸组小鼠一般状态尚可,体重较模型组增长明显(P0.05)。肝组织HE、Masson染色结果显示:模型组小鼠肝纤维化程度较重(造模成功),与其相比,藏红花酸组小鼠肝纤维化程度有所改善,差异有统计学意义。与模型组相比,藏红花酸组肝组织p38MAPK表达显著下降(P0.05)。结论:藏红花酸能有效减轻小鼠肝损伤及纤肝维化程度,其抗肝纤维化的机制可能与下调p38MAPK蛋白的表达有关。     

骨形成蛋白(BMP)-2/4，-5与IA型BMP受体在口腔正常上皮、良性病变及癌变中的表达分析

认识BMP及其受体与口腔正常上皮及其癌变的关系。有助于深入了解口腔上皮癌变的机理。本文用免疫组织化学方法对BMP-2/4,-5与BMPR-IA在口腔颊部粘膜正常上皮,良性病变和癌变中的表达进行观察和半定量分析。标本包括：9例正常上皮（normal buccal muosa,NB)。8例慢性炎症（nonspecific chronic inflammation,NCI),7例过度角化（hyperkeratosis,HK)。5例乳头状瘤（squamous cell papilloma,SCP)。29例鳞癌（squamous cell carcinoma,SCC)。10例癌旁上皮（epithelium immediately adjacent to carcinoma,EAC)以及6例硬腭粘膜上皮（normal mucosa of hard palate,NHP）。结果显示：BMP-2/4,-5与BMPR-IA在口腔粘膜的正常与良性病变上皮中有弱的和不均一的阳性表达,NB与NHP无明显差别,而除3例SCC外,其它SCC几乎均有程度不一的阳性表达,在EAC中的表达接近于SCC,二者明显高于正常与良性组,此外,转移在淋巴结中的癌细胞的BMP-2/4与BMP-5阳性程度略高于原发灶的癌细胞,本文认为;BMP-2/4,5与BMPR-IA可能参与调控口腔上皮的癌变。     

转移核糖核酸(tRNA)与癌症

转移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)在蛋白质生物合成过程中起关键作用,是将遗传信息翻译成蛋白质一级结构的接头分子。tRNA长久以来一直被认为是基因表达调控过程中的执行者而不具备调控功能,更不曾与癌症的发生联系起来。最新研究表明,某些tRNA在癌细胞中异常表达,与癌症的发生和发展有密切联系。tRNA来源的小分子非编码RNA (tRFs和tiRNAs)是一类新的基因表达调控分子,tRFs可以调控癌基因的表达或者与RNA结合蛋白相互作用来调控癌细胞增殖和细胞周期进程。tRNA的转录后修饰能够调控mRNA翻译过程,进而影响癌细胞的生长。随着测序技术的发展,tRNA在癌症发生和发展中的调控作用成为近年来的研究热点,现将从"tRNA分子调控癌症的发生和发展"、"tRNA来源的小分子非编码RNA与癌症"以及"tRNA修饰与癌症"三个方面综述tRNA分子在癌症发生和发展中的调控功能。     

小鼠肝再生过程中ROS及线粒体代谢变化规律的研究

目的:肝脏是维持人体发挥功能的重要器官,同时肝脏再生能力十分强大。本文通过部分肝切除术后小鼠肝再生模型,观察肝再生过程中氧化应激及线粒体代谢变化规律,以期为将来的调控肝再生提供新的干预靶点。方法:选择雄性健康体重均匀的Balb/c小鼠,采用经典70%肝切除模型,随机分为假手术对照组(Sham组)以及70%肝切除组(70%PH组)。肝切除术后6 h、1d、2 d、3 d、5 d、7 d不同时间点取肝组织,制备冰冻切片检测活性氧(ROS)水平,Western blot分别检测细胞增殖相关蛋白PCNA、Cyclin D1;氧化应激相关蛋白SOD1、SOD2、CAT、GPX1;以及线粒体代谢相关蛋白PGC-1α、Nrf1、TFAM、Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2、OPA1的表达并分析其变化规律。结果:70%肝切除术后小鼠肝脏增长迅速,细胞增殖关键蛋白PCNA和Cyclin D1表达显著增加;在此过程中细胞ROS水平呈现先升高后降低的变化,细胞主要抗氧化酶SOD1、SOD2、CAT、Gpx1与ROS相一致出现先升高后降低的变化。线粒体生物合成调控因子PGC-1α、Nrf1、TFAM呈现先降低后升高的趋势,而线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1呈现先降低后显著升高的趋势,线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2和OPA1总体为先降低后恢复至正常水平。结论:在小鼠70%肝切除再生过程中,存在着明显的氧化应激,线粒体生物合成增加,线粒体分裂/融合平衡偏向分裂,并且这些变化呈现具有一定的时间变化规律,这些变化及规律很可能作为将来调控肝再生的重要的潜在干预靶点。     

α-SMA与肿瘤发展相关性的研究

以小鼠的肝、肺组织的正常细胞与肝肿瘤细胞（Hepa1-6）、肺肿瘤细胞（LLC）为研究对象,通过CTFM（cell traction force microscopy）法测定了4组细胞系的牵引力;用荧光抗体染色技术比较了小鼠细胞的α-SMA蛋白在癌变前后的变化。实验发现：与小鼠正常细胞相比,在α-SMA的表达水平上,Hepa1-6细胞α-SMA的平均光密度减小了47.9%,LLC细胞下降了52.3%;而Hepa1-6细胞牵引力的均方根值减小了53.4%,LLC细胞减小了49.7%。这说明α-SMA的表达与牵引力的变化以及细胞癌变的过程是密切相关的。     

大鼠肝再生过程中肝细胞质膜微区差异蛋白质鉴定与分析

动物肝是具有极强再生能力的器官,研究并阐明肝再生的机制可为肝移植等与肝损伤相关的疾病治疗提供理论依据.质膜包括“脂筏(lipid rafts)”和“质膜微囊(caveolae)”的微区,具有参与胞吞胞饮、信号转导、运输胆固醇等重要功能.肝再生过程中,肝质膜微区脂筏蛋白质受到内部调控的影响会发生改变. 捕获脂筏微区信号蛋白分布的变化,对于理解和阐明肝再生过程中信号通路途径有重要意义.本研究应用成熟的大鼠2/3肝切除模型结合蔗糖密度梯度离心法,提取假手术组与肝再生组大鼠肝细胞质膜,并进一步纯化获得质膜微区蛋白质.通过SDS-PAGE分离以及ESI-Q-TOF质谱鉴定,对获得的质膜微区蛋白质进行差异分析. 结果显示,有30个微区蛋白质差异表达,其中13个上调、17个下调.生物信息学分析表明,所鉴定到的蛋白质主要参与细胞增殖、程序性死亡、细胞凋亡等调控,同时涉及到与肝再生密切相关的血管生成等信号通路.本文为质膜微区蛋白质的研究提供了方法上的参考以及相关基础数据,为后续临床肝再生的研究奠定了一定的基础.