来源于Laceyella sp.的α-淀粉酶基因克隆、重组表达及酶学性质研究

从土壤中筛选产淀粉酶菌株,对其淀粉酶基因进行克隆及异源表达,分析其酶学性质。采用固体淀粉筛选培养基,从安阳面粉厂附近土壤里分离得到一株产淀粉酶的菌株Laceyella sp.,编号为MF-8-1。然后利用同源克隆的方法得到淀粉酶编码基因AmyL。将AmyL与表达载体pET-22b(+)连接构建pET-22b-AmyL重组质粒,并转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达。最后对重组酶进行分离纯化以及酶学性质测定。AmyL在E.coli中成功表达,重组酶AmyL分子量为55 kD,最适反应温度为45℃,最适pH值为6.0。在温度低于60℃时,有较好的温度稳定性;在pH 6.0-10.0内较稳定。酶的动力学研究表明,该酶的比活、Km和Vmax分别为185.39 U/mg、0.95 mg/mL、343.12μmol/(min·mg)。结果表明,AmyL在中温碱性条件下具有高活性且保持稳定,在洗涤剂、纺织、造纸等行业具有潜在的应用价值。     

地衣形芽孢杆菌热稳定α淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

利用λ噬菌体作为运载体,在大肠杆菌中从直接鸟枪法分离出编码地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶的基因。将含有α-淀粉酶基因的片段再克隆进pBR322,并测定了它的限制性图谱。头肠杆菌克隆子所产生的α-淀粉酶保留了地衣形芽孢杆菌酶的热稳定性。检定了在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中这二基因产物的表达及性质。     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化

对本室构建的生产海藻糖的基因工程菌株,即来自古细菌芝田硫化叶菌B12的新型α淀粉酶基因的工程菌的表达外源蛋白条件进行宿主菌,培养基,诱导时间,诱导温度和诱导菌浓的起始OD600等条件的优化,发现在宿主菌为大肠杆菌DH5α,培养基为改进的LB,诱导时间4小时,诱导温度41℃,OD600为06～08时,基因工程菌ESBAM中新型α淀粉酶的表达量最高,新型α淀粉酶活力也最高,与重组酶MTSase一起作用底物直链淀粉,经HLPC检测在反应产物中有海藻糖的生成。     

解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因的克隆、表达与酶学性质分析

以中温α-淀粉酶生产菌株Bacillus amyloliquefaciens M23基因组DNA为模板。PCR扩增得到了2．0kb α-淀粉酶基因全长序列。该基因由上游启动子220bp,结构基因1544bp和终止序列320bp构成。将无信号肽的α-淀粉酶结构基因amyQ,克隆入表达载体pET28a,转化E．coli BL21（DE3）,经诱导,测定α-淀粉酶活性。结果表明：α-淀粉酶基因amyQ获得了活性表达,酶活力为2．297U／mL,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为58kDa特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,重组α-淀粉酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为6．5,在60℃保温15min保持85％以上活性,超过15min,酶迅速失活,在pH5．5～10．0环境下稳定。水解产物分析表明：淀粉水解终产物主要为麦芽寡糖和糊精和少量葡萄糖。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

目的:筛选高产α-淀粉酶菌株,为工业生产α-淀粉酶提供储备菌株。方法:利用碘液显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产α-淀粉酶菌株;通过菌落形态、菌体特征观察和16S rDNA序列比对对菌种进行鉴定;发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后,对其酶学性质进行初步研究。结果:从土壤中筛选到一株高产α-淀粉酶菌株,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XL-15。该菌株所产α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH为6.5;Ca2 和Mn2 对酶有激活作用,而Cu2 、Zn2 和EDTA对酶有抑制作用;酶的动力学研究测出米氏常数Km值为1.726mg/mL。结论:该菌株是产α-淀粉酶的较好材料,且具有一定的应用前景。     

来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 140kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET-2.2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH3.2 ,在pH 2.5～4.6范围内 ,酶活性保留 50%以上 ,它的最适温度65℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持50%以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+3288bp的基因片段amy′全长 2115bp ,编码705个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达*

用PCR方法从嗜热古菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶成熟肽结构基因 ,插入 pUC19中构建成质粒 pUC19 amy。将 pUC19 amy外源片段接入酿酒酵母表达载体 pYX2 12多克隆位点 ,构建成载体 pYX2 12 amy ,电转化酿酒酵母W 30 3 1A。转化子成功表达出有活性的高嗜热α 淀粉酶。重组酶具有与P. furiosus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适 pH为 5 0 ,最适温度约为 90℃ ,在 12 1℃下热处     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取,生产成本高,限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道,但由于产酶水平低下,因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达,缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)对该重组酶表达的影响,并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子,构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element,CRE),降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应,重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD,水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50°C,最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,酶活最高可达97.16 U/mL发酵液,比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍,为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。     

一种耐热偏酸性β-甘露聚糖酶基因克隆与高效表达

【目的】克隆半纤维素降解高效菌株Bacillus subtilis BE-91的甘露聚糖酶基因并进行原核表达,对表达产物进行酶学性质研究。【方法】采用PCR扩增法从B. subtilis BE-91菌株中克隆β-甘露聚糖酶基因,分别连接到pEASY-E1和pET28a载体,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。用DNS法对工程菌株的胞内和胞外β-甘露聚糖酶进行定量分析,选取胞外甘露聚糖酶活力高的组分进行酶学性质研究。【结果】从B. subtilis BE-91菌株中克隆的β-甘露聚糖酶基因(GenBank登录号：KP277209)在E. coli中获得高效表达,工程菌株pEASY-man/BL产胞外β-甘露聚糖酶的活性可达229.1 IU/mL;该基因序列全长960 bp,包含319个氨基酸的编码序列和一个终止密码子;表达产物的最适反应温度为65 °C,最适反应pH为6.0,属于耐热偏酸性β-甘露聚糖酶;该酶稳定温度≤65 °C,稳定pH为4.5?7.0;1 mmol/L的Cu2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+对该酶有激活作用,而Ba2+和Pb2+有强烈抑制作用。【结论】B. subtilis BE-91拥有珍贵的β-甘露聚糖酶基因资源,其胞外表达产物的耐热偏酸性酶学性质在开发饲料添加剂方面具有潜在的应用前景。     

臭腹腺蝗肠道中共存的淀粉和纤维素消化酶的纯化、动力学和抑制研究（英文）

【目的】本研究旨在了解臭腹腺蝗 Zonocerus variegatus 中碳水化合物的消化。【方法】依次通过CM-Sepharose CL-6B 阳离子交换、QAE Sephadex A-50阴离子交换以及Sephadex G-100凝胶过滤,对臭腹腺蝗中肠的酶粗提取液（其中α-淀粉酶和纤维素酶的比活性分别为283±1.72 U/mg和 17±0.83 U/mg）进行了纯化。最后通过层析将共存的酶分离成α-淀粉酶和纤维素酶。【结果】这两种酶都是单体,α-淀粉酶分子量为38 kDa ,纤维素酶分子量为21 kDa。α-淀粉酶对淀粉的K_m 值为 13.8±1.29 mg/mL,V_max为3 883±52.25 U/mg pro;而纤维素酶对羧甲基纤维素底物的 K_m 值为5.03±0.57 mg/mL ,V_max为433.00±5.24 U/mg pro 。臭腹腺蝗α-淀粉酶能以不同的效率水解原淀粉,纤维素酶也能不同程度水解各种纤维材料。α-淀粉酶的水解活性在pH 6和40℃下最高,而纤维素酶的水解高活性在pH 9和45℃下最高。【结论】 从番木瓜 Carica papaya 种子中分离到蛋白类抑制剂,发现它们是这两种酶的有效抑制剂,说明这些蛋白抑制剂(CpAI和 CpCI)如果在害虫取食的作物上过量表达,则可能有利于害虫防治。尽管纤维类和淀粉类物质可能都显著提供该害虫的能量需求,但是动力学分析表明臭腹腺蝗更偏向于淀粉类食物。     

淀粉结合域与α-淀粉酶的融合表达及其酶学性质

利用RT-PCR从Rhizopus oryzaeGX-08总RNA中克隆到糖化酶的淀粉结合域(SBD)基因(sbd),将该基因片段插入α-淀粉酶(CN7A)基因cn7a的5′端构建融合表达质粒pSE-sbdcn7a。嵌合酶SBD-CN7A在Escherichia coliJM109表达,并经Ni-NTA、Sephacryl S300纯化。酶学性质研究表明:嵌合酶在最适作用条件方面与原始酶并无明显差别;在以生玉米粉为底物时,其比酶活提高了8.7倍,而以可溶性淀粉为底物时其比酶活是原始酶的1.8倍,Km也从3.784 g/L降低为2.234 g/L;嵌合酶在65℃下的半衰期从10 min缩短为4 min。结果表明,淀粉结合域SBD的融合赋予了α-淀粉酶CN7A水解生淀粉的能力。     

耐热型α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

应用PCR法从火山口嗜热菌中克隆出了α-葡萄糖苷酶基因,并将该基因导入大肠杆菌,获得了稳定表达的大肠杆菌菌株。同时对其表达产物进行了酶学性质分析。结果表明：该基因长1587bp,编码501个氨基酸,为新舡葡萄糖苷酶同源基因,已将该序列在Genbank中登记;其表达产物经SDS-PAGE分析表明,相对分子质量约为66kD;该α-葡萄糖苷酶的最适温度为90℃,最适pH值为7．0,在80℃放置3h,酶活仍能达到94％以上。结果表明该酶具有优良的耐热性,将有广泛的工业应用前景。     

斜纹夜蛾中肠糖代谢相关基因的克隆及表达模式分析

斜纹夜蛾Spodoptera litura是一种世界性分布的重要农业害虫, 在生长发育过程中要经历幼虫 蛹的变态发育过程。由于变态发育前后昆虫的食性发生了明显的改变, 作为食物消化吸收的中肠也发生了解体和重建。与此相适应, 昆虫中肠的各种物质和能量代谢也可能会相应地发生改变。为研究斜纹夜蛾中肠变态发育过程中糖代谢途径的变化情况, 我们从斜纹夜蛾中肠EST文库中鉴定出了12个糖代谢相关基因, 克隆了其中3个基因的全长cDNA, 并应用半定量PCR和定量PCR的方法检测了其在幼虫 蛹变态发育期中肠组织的转录表达以及对激素和饥饿等因素的响应情况。结果表明： 这3个基因（α-L-岩藻糖苷酶、 N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶和烯醇化酶基因）的开放阅读框分别为1 461, 1 200和1 299 bp, 预测的分子量分别为56.3, 43.3和46.7 kDa。这12个糖代谢相关的基因在变态发育期的中肠组织中具有5种不同的mRNA表达模式： （Ⅰ）只在幼虫期高表达（唾液麦芽糖酶前体蛋白、 糖基水解酶31家族成员蛋白、 线粒体乙醛脱氢酶、 β-1,3 葡聚糖酶基因）; （Ⅱ）只在预蛹期高表达（β-葡萄糖醛酸酶、 β-N-酰基氨基葡萄糖苷酶3基因）; （Ⅲ）只在蛹期高表达（葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）; （Ⅳ）在预蛹期和蛹期高表达（α-葡萄糖苷酶、 α-淀粉酶、 N-乙酰葡糖胺 6 磷酸脱乙酰酶和α-L-岩藻糖苷酶基因）; （Ⅴ）在变态发育期恒定表达（烯醇化酶基因）。这说明, 为适应变态发育斜纹夜蛾中肠糖代谢途径发生了明显的改变。保幼激素对这些基因的表达没有明显的影响, 但蜕皮激素对Ⅰ类基因（如糖基水解酶31家族成员蛋白基因）具有一定的抑制作用, 对Ⅲ类基因（如葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）有显著的上调作用。此外, 我们还发现饥饿对几乎所有这些基因的表达都有显著的抑制作用。这些结果说明, 昆虫中肠变态发育过程中糖代谢相关基因的动态变化可能受到蜕皮激素以及饥饿相关因素的共同调控。这一研究对从代谢角度揭示昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。