普鲁兰酶基因在解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株中的分泌表达

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP。将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株。摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48h酶活达到最高水平,为2．8ASPU／mL。酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5．0,60℃保温3h仍保存50％的活性。重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求。     

耐热型α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

应用PCR法从火山口嗜热菌中克隆出了α-葡萄糖苷酶基因,并将该基因导入大肠杆菌,获得了稳定表达的大肠杆菌菌株。同时对其表达产物进行了酶学性质分析。结果表明：该基因长1587bp,编码501个氨基酸,为新舡葡萄糖苷酶同源基因,已将该序列在Genbank中登记;其表达产物经SDS-PAGE分析表明,相对分子质量约为66kD;该α-葡萄糖苷酶的最适温度为90℃,最适pH值为7．0,在80℃放置3h,酶活仍能达到94％以上。结果表明该酶具有优良的耐热性,将有广泛的工业应用前景。     

超耐热酸性α-淀粉酶基因的克隆及其在酵母细胞中的表达

用PCR方法扩增来源于极端嗜热厌氧古菌Pyrococcus furiosus中的超耐热酸性α-淀粉酶的结构基因,将该结构基因引入载体pPIC9K中,将重组质粒pPIC9K-Amy转化大肠杆菌DH5α细胞,测序结果表明,克隆到的α-淀粉酶结构基因为1305bp,其编码的成熟肽为435个氨基酸。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞,得到酵母工程菌株。在酵母α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,超耐热酸性α-淀粉酶在甲醇酵母中大量表达并分泌到胞外,该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,随着诱导培养时间的增加,在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升,在诱导培养7d后酶活力达到最大值。该酶最适反应温度为90~100℃,最适反应pH值为4.5~5.5。该酶具有非常好的温度稳定性,在100℃条件下热处理5h,仍具有60%以上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用。     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

Secreted expression of the pullulanase in Bacillus amyloliquefaciens BF7658

根据文献报道的核苷酸序列合成Bacillus deramificans普鲁兰酶成熟肽编码基因BdP.将BdP基因插入芽孢杆菌分泌表达载体pUC980信号肽编码区下游,获得重组质粒pUC980-BdP,重组质粒转化中温α-淀粉酶生产菌解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株.摇瓶发酵实验表明,重组转化子发酵液有明显普鲁兰酶酶活,约48 h酶活达到最高水平,为2.8 ASPU/mL.酶学性质分析表明,重组酶最适作用温度约为60℃,最适反应pH为5.0,60℃保温3h仍保存50％的活性.重组酶性质适合淀粉糖化工艺的要求.     

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrocccus furiosus的基因组DNA中扩增出胞外α-淀粉酶成熟肽结构基因,插入pUC19中构建成质粒pUC19-amy,将pUC19-amy外源片段接入酿酒酵母表达载体pXY212多克隆位点,构建成载体pYX212-amy,电转化酿酒酵母W303-1A,转化子成功表达出有活性的高嗜热α-淀粉酶,重组酶具有P.furiosus产生的胞外α-淀粉酶相似的酶学性质,最适pH为5.0,最适温度约为90℃,在121℃下热处理30min酶活仍能保持50%以上。     

扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达与重组酶性质

通过PCR方法从扣囊复膜孢酵母基因组DNA中克隆获得α-淀粉酶基因成熟肽编码区（SfA）,插入乳酸克鲁维酵母表达载体pKLACl的d因子信号肽下游,构建重组表达载体pKLACl-SfA。重组载体转化乳酸克鲁维酵母GG799,筛选获得表达α-淀粉酶SfA水平较高的重组茵。酶活检测和SDS．PAGE电泳检测均显示,重组茵分泌重组酶SfA到发酵液中。酶学性质研究表明：SfA最适温度为45℃,最适pH5．0,在pH4．5～5．5、50℃条件下保持稳定。Ca2＋等二价金属离子对SfA酶活有激活作用,EDTA强烈的抑制SfA活性。HPLC分析显示SfA水解糊精获得麦芽寡糖和少量葡萄糖,其中麦芽三糖是主要产物,占水解产物总量的52％。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

根据已知α-淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列,通过PCR和反向PCR技术克隆出Bacillus licheniformisCICIM B0204α-淀粉酶编码基因amyL全长序列及其上下游序列。B.licheniformisCICIM B0204amyL由1539bp组成,其上游180bp为启动子序列,下游160bp为终止子序列;成熟肽由512个氨基酸残基组成,氨基端的29个氨基酸残基为α-淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现,amyL及其编码产物与芽孢杆菌来源的α-淀粉酶具有高度相似性。将amyL的结构基因在PT7介导下于大肠杆菌中诱导表达,获得具有α-淀粉酶活性的表达产物。将amyL的启动子序列和信号肽序列与B.licheniformisCICIM B2004的β-甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组,在大肠杆菌中获得了β-甘露聚糖酶的分泌表达,重组大肠杆菌表达295U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。     

碱性α-淀粉酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究

将已克隆的碱性α-淀粉酶基因信号肽编码序列去除,用PCR的方法加入酶切位点,然后与表达载体pHIS1525连接转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-JH,并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌YYBm1原生质体,获得基因工程菌YYBm1 -pHIS1525-JH.SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达.酶学性质研究表明,该酶的最适温度与pH值分别为60℃与pH8.5,在pH7.0 - 10.5之间具有较好的稳定性,Km值为1.94 mg/mL,酶活力可达2516.5 U.     

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示。其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动予下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6．0。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

耐酸耐热α-淀粉酶高产菌株选育的初步研究

目的：从长期高温堆放的富含淀粉质的土壤里筛选高产α-淀粉酶的菌株并对及产酶条件和酶学性质进行研究。方法：采用平板筛选法获得目的菌株,用观察形态和基因组16S基因序列分析相结合的方法进行鉴定,通过单因素和正交实验确定最适产酶条件,并提取粗酶液研究酶反应条件。结果：得到高产α-淀粉酶的菌株Bacillussp.I15,最适产酶条件为：初始pH6.0,40℃培养时间36h。该酶最适反应温度为70℃,且具强耐热性,100℃下相对酶活性仍保持在78%以上;热稳定性高,且无Ca^2＋依赖性,100℃温育1h,酶活仍能保持66%;最适反应pH为7.0,且具有广谱耐酸性,在pH3.0～7.0之间相对酶活性均能保持在到67%以上。结论：Bacillussp.I15可高产耐热耐酸α-淀粉酶,具有良好的应用前景。     

芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

在仔猪结肠内容物中分离出一株能利用淀粉的芽孢杆菌Bacillussp.WS06,构建了全基因组DNA文库,从中筛选出α_淀粉酶基因amyF,分析测定了其核苷酸序列并进行了表达;其中amyF编码的蛋白有526个氨基酸、分子量为58.6kD;它与已报道的Bacillusmegaterium的α_淀粉酶序列有93%的同源性。经过氨基酸序列比较分析还发现,AmyF含有淀粉酶家族中4个高度保守的酶催化活性区。经多步纯化,重组酶的比活共提高了22.2倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS_PAGE检测,AmyF酶分子量为57kD。该酶的最适反应温度为55℃～60℃,酶的最适反应pH为7.0,在温度不超过55℃时,酶活较稳定;AmyF能迅速降解淀粉生成麦芽寡糖,属于内切糖苷酶。     

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus热稳定几丁质酶的克隆表达及活性研究

研究通过RT-PCR和Tail-PCR技术从嗜热子囊菌原变种Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus中克隆了一个几丁质酶同源基因。该基因全长1,253bp,包含一个由1,197个碱基构成的开放阅读框,编码398个氨基酸。序列比对分析表明,该基因编码蛋白属于糖苷水解酶18家族的几丁质酶。利用基因重组的方法构建酵母分泌型表达载体,并转化毕赤酵母。在甲醇的诱导下,重组蛋白得到了高效表达,第6天的表达量最高,达到0.433g/L,酶活力为28.96U/mg,同时对表达的几丁质酶进行了纯化,SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为43.9kDa。该几丁质酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH值为8.0,70℃处理30min仍有45%的相对酶活,具有较好的热稳定性及工业应用价值。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

极端嗜热α-淀粉酶ApkA的高温活性和热稳定性的优化研究

旨在获得高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶。通过向α-淀粉酶Apk A中引入目前已知的最稳定的α-淀粉酶PFA的Zn~(2+)结合位点,获得Zn~(2+)结合位点突变体ApkAds K152H/A166C。酶学性质分析表明,ApkAds K152H/A166C的高温活性和热稳定性明显提高,最适反应温度由90℃提高至100℃,对应的酶比活力为5 201.08 U/mg。ApkAds K152H/A166C于90℃的半衰期由5 h延长至10 h,于100℃的半衰期由7.5 min延长至80 min。重组α-淀粉酶中Zn~(2+)含量测定结果显示ApkAds K152H/A166C结合了一个Zn~(2+)。结果表明,向ApkA中引入Zn~(2+)结合位点有利于提高其高温活性和热稳定性。     

南极深海沉积物宏基因组DNA中低温脂肪酶基因的克隆、表达及性质分析

从南极普利兹湾深海900米深的沉积物中提取获得宏基因组DNA,并通过设计引物,从中克隆到全长为948bp的低温脂肪酶(lip3)开放阅读框完整序列,该基因编码一个由315个氨基酸残基组成、预计分子质量为34.557ku酶蛋白(Lip3);氨基酸序列上的GFGNS(GXGXS)和G-N-S-M-G(GXSXG)在许多脂肪酶中有很高的保守性,它们是水解机制所必需的序列,也是丝氨酸水解酶中最保守的序列.构建了lip3基因重组表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,采用镍离子亲和层析柱对表达的酶蛋白Lip3进行纯化,得到约35ku蛋白条带,酶学性质的分析表明,该酶的最适作用温度为25℃,在0℃时表现为最高活力的22%,最适pH值为8.0,对热敏感,35℃热处理60min剩余酶活为10%,以硝基苯棕榈酸酯为底物,Lip3的酶促反应常数Km值随着反应温度的升高而升高,是典型的低温酶.     

嗜热子囊菌Thermoascus crustaceus JCM12803来源的低温α-淀粉酶功能验证及其适冷机制分析

【目的】挖掘新颖的低温α-淀粉酶基因资源,并对其适冷机制进行分析,可以加深我们对低温酶的认识并为酶分子改良提供科学依据。【方法】根据嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus) JCM12803全基因组序列信息,利用PCR的方法获得一个α-淀粉酶基因Tcamy,将其插入至表达载体pPIC9后,在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115中异源表达,测定其酶学性质。同时采用氨基酸序列分析和同源建模的方法获得其三维结构,分别从蛋白序列-结构-功能层面上研究其适冷机制。【结果】Tc Amy是一个典型的低温α-淀粉酶,最适温度35°C,在0°C下保持有27%的活性。序列和结构分析表明该酶N-糖基化修饰程度低,Arg和Pro含量低而Gly含量高且二硫键和离子键较少。【结论】本研究获得了一个低温α-淀粉酶,低N-糖基化以及特殊的氨基酸组成和蛋白分子内作用力是其适应低温的根本原因。     

大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基因克隆表达及其酶学特性研究

通过PCR克隆得到了不包括信号肽序列的109～1803bp大黄欧文氏菌蔗糖异构酶基因,以pQE30为表达载体可以在大肠杆菌中高效表达SI基因,但容易形成包涵体。通过降低诱导剂IPTG至10μmol／L,28℃低温诱导表达可以改进表达产物的可溶性。重组SI的最适pH为6．0,最适反应温度为30℃。测定的Km为46．8mmol／L,Vm甜为152．2u／mg。重组SI对麦芽糖、海藻糖、棉子糖、三氯蔗糖及廿甲基葡萄糖苷等均不起作用,只利用蔗糖为底物转糖苷,也可以水解对硝基苯酚-α-葡萄糖苷。同时发现重组SI具有转化异麦芽酮糖生成海藻酮糖的活性。