细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

耐碱性木聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质

摘要：【目的】从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因,将其在巨大芽孢杆菌中进行表达,并对表达产物进行性质分析。【方法】将克隆得到的木聚糖酶基因xynA以及带有自身启动子序列的结构基因, 构建在芽孢杆菌表达载体pWH1520和改造后的载体pWG03中,得到重组质粒pWTEJX和pWGXYN,分别转化到巨大芽孢杆菌BM70中,获得重组巨大芽孢杆菌BMJXH9和BMGpp12;经过诱导产酶培养,均得到分泌表达。【结论】重组巨大芽孢杆菌BMGpp12比BMJXH9产酶活力提高了三倍     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp. N16-5表达载体的构建

【目的】构建可以在嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5中表达外源基因的表达载体。【方法】以枯草芽孢杆菌表达质粒pHCMC04为基本骨架,删除木糖诱导的启动子和木糖阻遏蛋白基因,分别插入枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和嗜碱芽孢杆菌N16-5的组成型启动子P EF,构建表达载体pABN165P43和pABN165P EF;将绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因连接至表达载体得到pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp,利用原生质体转化法将其转化至Bacillus sp.N16-5,通过荧光显微镜和多功能荧光读板仪检测报告基因的表达情况。【结果】所构建的表达载体pABN165P43-gfp和pABN165P EF-gfp可以在Bacillus sp.N16-5中表达报告基因gfp,荧光定量数据显示,在7.5 h左右开始检测到绿色荧光蛋白的表达,从7.5 h到12 h荧光强度随时间增长迅速并在12 h左右达到最大,最大荧光值在7000左右。【结论】成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.N16-5表达载体,实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

枯草芽孢杆菌β-糖苷酶的克隆表达、体外定向进化及结构模拟

摘要:【目的】从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出bglC基因并在大肠杆菌中表达,分析表达产物的酶学性质并进行结构模拟,为进一步研究其生理功能及结构解析奠定基础。【方法】将bglC基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,通过定向进化获取水解效率提高的突变株,经Ni-NTA镍离子层析柱纯化后,测定野生枯草芽孢杆菌β-糖苷酶与突变酶的性质。利用CD光谱,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及三维结构建模,分析野生酶与突变酶的高级结构。【结果】野生酶的比活力为9.7 U/mg,最适催化温度为60℃,最适pH值是7.0。经过突变和筛选,我们得到一个突变体BS-GLY_M1(A242T/T385A/S425L),其比活力达到17.1 U/mg,最适温度为55 ℃,最适pH值是7.0,在55 ℃下的半衰期为3.5 h,比野生酶增加2 h。突变酶对4-硝基苯基-β-半乳糖苷、乳糖和熊果苷的催化效率(Km/Kcat)有所提高。酶在天然条件下以二聚体、四聚体状态存在,推测它以二聚体为基本功能单位。结构模拟结果表明突变后酶的三维结构有轻微地变化,这可能是酶热稳定性和催化效率提高的原因。【结论】枯草芽孢杆菌β-糖苷酶可以在大肠杆菌中高效表达并可以通过定向进化提高其水解效率。     

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达

目的:克隆解淀粉芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA)使其在解淀粉芽孢杆菌CICIM B4081中高效表达,并对重组酶进行酶学性质研究.方法:以解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)染色体DNA为模板,经过PCR扩增得到了大小约为0.8kb的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglA),构建了重组表达质粒pQ-bglA,通过电转化的方法将其转化人解淀粉芽孢杆菌(CICIM B4801)中.结果:得到了能高效表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶的重组解淀粉芽孢杆菌.在250mL摇瓶条件下,重组菌分解地衣多糖的胞外最高酶活达到了1515.7U/mL,重组酶的最适作用温度为55℃,最适反应pH值为6.5.结论:重组菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活为原始菌株的11.84倍,实现了bglA基因在解淀粉芽孢杆菌中的高效表达.     

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的克隆与重组表达及其酶学性质研究

【目的】克隆嗜热脱氮土壤芽孢杆菌中的β-葡萄糖苷酶基因bglB,在E.coli中异源表达,纯化并研究其酶学性质。【方法】利用PCR技术从嗜热脱氮土壤芽孢杆菌的基因组DNA中克隆得到bglB基因,将该基因克隆到表达载体pGEX-2TL上并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对纯化后的β-葡萄糖苷酶的酶学性质及寡聚状态进行分析。【结果】重组表达的β-葡萄糖苷酶最适温度为65°C,最适pH为7.0,能在pH 5-10、60°C下稳定存在4 h,并能在较高的离子强度(880 mmol/L K+)下发挥其功能。Al3+离子对其有强烈的激活作用,Co2+有一定的抑制作用。最适反应条件下该酶比活力为0.043 IU/mg。该酶具有多种寡聚体形式,这些寡聚体均有β-葡萄糖苷酶活性。【结论】获得一个耐热耐盐的中性β-葡萄糖苷酶,为进一步研究β-葡萄糖苷酶的催化作用机理,提高其热稳定性提供一定的帮助。     

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

从巨大芽孢杆(Bacillus megaterium)的全基因组DNA文库中筛选出一个β-淀粉酶基因amyG,分析测定了其核苷酸序列并进行了诱导表达;其中amyG编码的蛋白有545个氨基酸、分子量为60.194 kD,与已报道的巨大芽孢杆菌DSM319的β-淀粉酶序列有着94.5%的同源性.经氨基酸序列比较分析发现,AmyG从N末端到C末端依次由信号肽域、糖基水解酶催化功能域和淀粉结合域3个功能域组成.其中催化功能域里含有第14家族糖基水解酶常见的几个高度保守的酶催化活性区.经多步纯化,重组酶的比活共提高了7.4倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS-PAGE电泳测定,酶AmyG的分子量为57 kD.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7.0;在温度不超过60℃时,酶活较稳定:AmyG能迅速降解淀粉生成麦芽糖,属于外切β-糖苷酶.     

碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达

【背景】碱性蛋白酶是工业用酶中占比最大的酶类,广泛应用于清洁、食品、医疗等行业。近期研究发现碱性蛋白酶在生产生物活性肽方面有巨大潜力,这将进一步拓宽其在保健食品领域中的应用。【目的】利用枯草芽孢杆菌异源表达地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶SubC。【方法】通过筛选3种枯草芽孢杆菌宿主菌株(Bacillus subtilis 1A751、MA07、MA08)和6种信号肽(AmyE、AprE、NprE、Pel、YddT、YoqM),同时优化诱导剂浓度、发酵培养基和发酵时长,最终得到最优重组菌株MA08-AmyE-subCopt。【结果】重组菌株MA08-AmyE-subCopt的胞外酶活力为3.33×103 AU/mL,胞外蛋白分泌量为胞内可溶蛋白表达量的4倍,与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比,酶活提高了73.4%。【结论】异源碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中成功表达,为碱性蛋白酶SubC的表达和在保健食品领域的工业化应用提供了理论基础。     

木糖酸氧化途径在枯草芽孢杆菌的构建及转化乙醇酸的研究

通过过表达外源基因,旨在获得一株生产乙醇酸的食品安全菌。通过构建质粒在枯草芽孢杆菌A164S中过表达来自大肠杆菌的木糖酸降解途径,并用高效液相色谱对产物进行检测。诱导质粒表达后,重组枯草芽孢杆菌菌株成功地将木糖酸转化为乙醇酸,摩尔转化率达到42.54%。同时,枯草芽孢杆菌自身因存在非特异的醛缩酶及乙二醛脱氢酶,能够在只表达木糖酸脱水酶YjhG的情况下获得生物转化木糖酸的能力。成功构建了一株可利用木糖酸生产乙醇酸的枯草芽孢杆菌,并发现了可能的YjhH同工酶的存在。     

麦芽糖诱导海藻糖合成酶基因在B.subtilis WB800n中的表达

运用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖诱导型启动子调控元件,构建得到麦芽糖诱导海藻糖合成酶的安全表达系统,使其制备的海藻糖能够广泛应用于食品医疗行业。以来源于恶臭假单胞杆菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)的海藻糖合成酶基因Tre S为报告基因,以cre序列定点突变(CG碱基突变为AT碱基)优化后的麦芽糖诱导型的枯草芽孢杆菌操纵元启动子Pglv为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒PHT01为载体骨架,通过Bam H I和Aat II限制酶酶切替换,构建得到高效表达载体Pglv-PHT01-Tre S,将质粒电转化到B.subtilis WB800n并验证其表达效果。成功构建了海藻糖合成酶高效表达质粒Pglv-PHT01-Tre S,并实现了该重组质粒在B.subtilis WB800n中的表达。利用基础发酵培养基优化发酵条件验证结果表明,菌体生长到发酵液吸光值OD600达到1.2时加入终质量分数4.5%的麦芽糖,37℃诱导18 h后胞内的海藻糖合成酶的粗酶活力达到18.9 U/m L。为了提高海藻糖合成酶的表达量,还构建了通过单交叉互换方法敲除了α-淀粉酶基因amy E的重组菌株B.subtilis WB800n(Δamy E),减少了胞外α-淀粉酶对麦芽糖的降解成葡萄糖,提高了麦芽糖的诱导表达效果以及减少葡萄糖的反馈抑制,表达质粒在麦芽糖诱导条件下在该重组菌中海藻糖合成酶酶活提高到了29.2 U/m L。首次成功实现了麦芽糖诱导海藻糖合酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,为获得制备安全高效的海藻糖合成酶表达系统奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组体。在25℃,110 r/min条件下,用IPTG诱导重组蛋白表达。表达蛋白用SDS-PAGE验证,并对酶活力进行测定。测序结果表明克隆序列与NCBI上的登录的序列同源性高达99%。SDS-PAGE结果表明诱导出的蛋白相对分子质量56.6 kD,酶活力达到39 U/mL。证明成功克隆得到枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。     

芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质

【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究。【方法】利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛。【结果】克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达。重组酶AprG最适反应温度为50°C,最适反应pH为10.0。各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强。底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低。AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显。【结论】蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景。     

海绵共生萎缩芽孢杆菌C89 PPTase bap基因的异源表达

【背景】磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化非核糖体肽合成酶(NRPS)中肽酰载体蛋白(PCP)从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态,从而启动非核糖体肽类化合物的生物合成。【目的】鉴定贪婪倔海绵共生萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap,验证Bap激活NRPS中PCP的能力。【方法】通过BLAST和氨基酸多序列比对鉴定萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株枯草芽孢杆菌168中异源表达,通过重组菌枯草芽孢杆菌168-bap的代谢物检测非核糖体肽类化合物Surfactin。【结果】Bap为Sfp型PPTase,检测到重组菌枯草芽孢杆菌168-bap中Surfactin的产生。【结论】本研究为海洋萎缩芽孢杆菌中NRPS基因簇的异源表达奠定了基础。     

浸麻类芽孢杆菌葡甘露聚糖降解酶的异源表达及功能研究

【目的】克隆表达浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的葡甘露聚糖降解酶,研究其性质和功能,丰富葡甘露聚糖降解酶资源,了解浸麻类芽孢杆菌降解葡甘露聚糖机制。【方法】检索浸麻类芽孢杆菌的葡甘露聚糖降解酶基因,构建重组菌株,表达纯化重组酶,系统研究其功能及在降解葡甘露聚糖中的作用。【结果】克隆表达了5个葡甘露聚糖降解酶组分。结果显示Pm Man1和Pm Man2为内切β-甘露聚糖酶,Pm Glc1、Pm Glc2和Pm Glc3为外切β-葡萄糖苷酶。其中Pm Glc1只能水解p NPβGlc,Pm Glc2能水解二糖和人参皂苷的β-1,6-葡萄糖苷键,而Pm Glc3对β-葡萄糖苷键的选择性较为广泛。Pm Man1、Pm Man2、Pm Glc2和Pm Glc3能够降解葡甘露寡糖,Pm Man1和Pm Man2可以降解葡甘露聚糖。共同降解葡甘露聚糖时,Pm Glc2和Pm Glc3与Pm Man2具有协同效应,且Pm Glc3与Pm Man2的协同作用更为显著。【结论】从浸麻类芽孢杆菌中获得了4种葡甘露聚糖降解酶,阐明了该菌葡甘露聚糖降解酶系成员的作用,丰富了酶资源...     

浸麻类芽孢杆菌葡甘露聚糖降解酶的异源表达及功能研究

【目的】克隆表达浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的葡甘露聚糖降解酶,研究其性质和功能,丰富葡甘露聚糖降解酶资源,了解浸麻类芽孢杆菌降解葡甘露聚糖机制。【方法】检索浸麻类芽孢杆菌的葡甘露聚糖降解酶基因,构建重组菌株,表达纯化重组酶,系统研究其功能及在降解葡甘露聚糖中的作用。【结果】克隆表达了5个葡甘露聚糖降解酶组分。结果显示PmMan1和PmMan2为内切β-甘露聚糖酶,PmGlc1、PmGlc2和PmGlc3为外切β-葡萄糖苷酶。其中PmGlc1只能水解pNPβGlc,PmGlc2能水解二糖和人参皂苷的β-1,6-葡萄糖苷键,而PmGlc3对β-葡萄糖苷键的选择性较为广泛。PmMan1、PmMan2、PmGlc2和PmGlc3能够降解葡甘露寡糖,PmMan1和PmMan2可以降解葡甘露聚糖。共同降解葡甘露聚糖时,PmGlc2和PmGlc3与PmMan2具有协同效应,且PmGlc3与PmMan2的协同作用更为显著。【结论】从浸麻类芽孢杆菌中获得了4种葡甘露聚糖降解酶,阐明了该菌葡甘露聚糖降解酶系成员的作用,丰富了酶资源和理论研究成果的同时,为酶法制备活性葡甘露寡糖提供了有效工具。     

长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及酶学性质研究

根据NCBI上报道的基因序列设计引物,以长野芽孢杆菌(Bacillus naganoensis)ATCC53909的染色体DNA为模板,PCR扩增普鲁兰酶编码基因pulB。将此基因与表达载体pWB980连接构建重组质粒pWB-pulB,并转化枯草芽孢杆菌WB600。SDS-PAGE结果显示,在100 kD处有特异性条带,经测定重组转化子粗酶液酶活力达10.94 U/mL。酶学性质分析表明,其最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0,且在温度30-60℃及pH4.0-6.0范围内稳定,适合淀粉加工行业的应用。     

坚强芽孢杆菌三个淀粉酶基因的克隆和表达

以pUC18为载体,用鸟枪法从产淀粉水解酶的坚强芽孢杆菌725菌株中得到三个产淀粉水解酶的重组质粒,在大肠杆菌中表达。用高压液相色谱分析了三个表达的酶的淀粉水解产物,其中pBA135和pBA150表达的酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖,具β-淀粉酶的性质。pBA140表达的酶的淀粉水解主要产物除麦芽糖外还有一糖,三糖和四糖。pBA135编码的酶有较好的热稳定性,60℃保温30min,活性保留70％以上,最适反应温度55-60℃。而在同样条件下pBA150编码的酶仅保留37％的酶活,最适反应温度50℃。