乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H。首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-TpepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48。然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H。利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应。     

食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达

为构建乳酸乳球菌食品级分泌表达载体,通过PCR扩增质粒pMG36e的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45),克隆到食品级载体pSH91中,构建食品级分泌性表达载体pSQ;克隆报告基因金黄色葡萄球菌核酸酶(NucA)成熟肽的编码序列nucA到pSQ中分泌信号后,转化乳酸乳球菌MBP71,构建了乳酸乳球菌食品级分泌性表达系统L lactis/pSQ-nucA;通过TB-D法和酶谱法检测L lactis/pSQ-nucA的表达形式、表达量并与以前构建的L lactis/pSQZ-nucA系统表达能力进行比较,结果发现L lactis/pSQ-nucA能够分泌性表达NucA,分泌性表达的NucA量大约是胞内NucA的10倍;L lactis/pSQ-nucA的表达量高于lactis/pSQZ-nucA.为进一步目的蛋白的的分泌性表达及食品级疫苗的研制奠定了基础.     

乳酸乳球菌基因表达载体系统的研究

乳酸乳球菌（IaCtOCOOCCClaCrts）是乳球菌属（IastOCOCCCS）最重要和最典型的一个种,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品及医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物［‘］。乳酸乳球菌中存在大量的染色体外因子（如质粒和噬菌体）,为其分子生物学研究和基因载体系统的发展提供了极好的材料。在近十多年中,随着乳酸乳球菌内源性质粒的去除和电穿孔转基因技术的建立以及乳酸乳球菌各类表达信号的分离和克隆,已建立和发展了一系列具有不同用途的乳酸乳球菌载体和受体系统。这些载体包括基本的…     

乳酸乳球菌载体疫苗

乳酸乳球菌是一种在食品工业中广泛应用的安全级微生物,应用基因工程手段能使乳酸乳球菌表达多种病毒、细菌、寄生虫的外源蛋白。乳酸乳球菌可经粘膜途径免疫,能有效递呈抗原,诱导外源蛋白的特异性免疫应答,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫,因此可作为潜在的疫苗载体。本文对乳酸乳球菌载体疫苗的优势、应用以及疫苗设计时需要考虑的问题进行了概述。     

表达空肠弯曲菌CfrA蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果北大核心CSCD

【目的】本试验将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,然后将重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,降低空肠弯曲菌在鸡肠道中的定殖。【方法】利用PCR分别扩增空肠弯曲菌cfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体pNZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900,通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况,同时通过筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平;进而将重组乳酸乳球菌经口服免疫SPF鸡,免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、以及诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平,最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡,通过测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。【结果】Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,不分泌,筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/mL、温度37°C、时间1 h。口服乳酸乳球菌10 d内自鸡体完全排空;鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。【结论】成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用,为研制重组乳酸菌口服家禽免疫制剂防治空肠弯曲菌奠定了基础。     

食品级乳酸乳球菌pNZ8149-luc质粒的构建及表达

目的:构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶报告基因(luc)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L.lactis)食品级表达系统,以便后续研究对目的基因进行示踪。方法:从pGL4.10质粒中PCR扩增萤火虫荧光素酶报告基因,测序,克隆至载体pNZ8149,构建pNZ8149-luc表达质粒;电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,采用乳糖筛选法获得重组的乳酸乳球菌,Nisin诱导,采用微孔板发光检测仪检测荧光素酶的存在,Western Blot检测目标蛋白luc的表达。结果:PCR扩增的荧光素酶报告基因成功克隆至pNZ8149质粒,并电击转化宿主乳酸乳球菌NZ3900,得到乳酸乳球菌表达系统NZ3900/pNZ8149-luc。Nisin诱导后,检测到荧光素酶随诱导时间的延长活性逐渐增强,时间超过24 h之后荧光素酶活性逐渐下降。Western Blot检测到目标蛋白luc在胞内表达。结论:成功构建了p NZ8149-luc表达载体,并能够在乳酸乳球菌体内稳定表达。     

乳酸菌载体pMG36e的应用现状

乳酸乳球菌通用表达质粒pMG36e是一个经典的人工构建的组成型表达载体,是以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成的。它包含一个强启动子,能够在多种细菌中表达外源蛋白。已用于研究细菌素作用机制,乳酸菌基因工程菌株的改造以及口服疫苗的开发等,应用领域十分广泛,已成为乳酸菌基因工程研究的重要工具质粒之一。本文主要从载体构成、基因表达与食品级载体改造等三方面的应用对其进行综述,旨在为该质粒今后研究提供资料。     

乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展

乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全级(generally recognized as safe,GRAS)微生物。近年来,对于乳酸菌作为宿主菌表达外源蛋白或抗原的研究取得了一定进展。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是乳酸菌的代表菌种,以其生长迅速、易于操作等优点成为表达外源抗原,作为黏膜免疫活载体疫苗的理想菌株。随着对乳酸乳球菌基因工程的研究逐渐深入,已发展了一系列组成型和诱导型乳酸乳球菌表达系统以及蛋白定位系统。破伤风毒素片段C、布氏杆菌L7/L12蛋白等多种病原微生物抗原已成功在乳酸乳球菌中表达,并已证明部分重组乳酸乳球菌作为黏膜免疫疫苗可以同时刺激局部黏膜免疫应答和系统免疫应答。目前,如何使活载体乳酸乳球菌以最佳方式向黏膜免疫系统提呈抗原继而诱导有效免疫反应是该领域的研究热点,也是巨大挑战。实现外源抗原在乳酸乳球菌中的准确定位及与细胞因子的共表达是未来研究的重要方向之一。乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递外源抗原具有广阔的应用前景。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白在乳酸菌中的表达

目的：构建猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的细胞内表达重组乳酸乳球菌,确定其最佳表达条件,为重组乳酸菌作为口服疫苗防治猪传染性胃肠炎奠定基础。方法：根据猪传染性胃肠炎病毒纤突（S）蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR,获得含有TGEV S基因4个主要抗原位点的约2000bp目的片段,将其与表达载体质粒pNZ8048进行连接,通过电转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽（Nisin）的诱导下进行表达,确定最佳表达条件;并通过SDS-PAGE进行检测和Western-blot分析表达蛋白活性。结果：成功获得了TGEV S蛋白在乳酸乳球菌细胞内的表达并且表达的蛋白具有TGE全病毒的抗原性。确定了乳酸乳球菌表达TGEV S蛋白的最佳表达条件为在以1ng/ml的乳链杆菌肽nisin诱导下,诱导后3h,重组蛋白表达效率达最高,重组蛋白约占菌体总蛋白含量的8．7％。结论：在乳酸乳球菌细胞内表达的重组TGEV S蛋白获得了理想表达,为进一步研制开发防治TGE口服疫苗提供物质基础。     

硬脂酰-辅酶A脱氢酶基因在食品级乳酸菌中的表达

为了实现硬脂酰-辅酶A脱氢酶1编码基因在乳酸乳球菌中的表达,采用PCR技术扩增获得人类scd1的编码序列。Nco I和Xba I双酶切后定向插入到食品级表达载体pNZ8149中,构建表达载体pNZ8149-scd1。电转化乳酸乳球菌NZ3900,经菌落PCR和测序鉴定scd1基因成功插入到乳酸乳球菌中。在乳链菌肽诱导下进行scd1的表达,转化株提取脂肪酸,进行脂肪酸含量的气相色谱分析。结果显示,SCD1转化菌株中的C16∶1n-7和C18∶1n-7脂肪酸组分比转化pNZ8149的对照组乳酸菌分别提高了92%~169%和53%~127%。文中以scd1基因为例,尝试并证明了脂肪酸脱氢酶类基因能够在食品级乳酸菌中有效表达,为后续研究奠定了基础。     

乙醛脱氢酶在乳酸乳球菌中的表达与纯化

目的:在乳酸乳球菌中重组表达乙醛脱氢酶(ALDH)。方法:合成毕赤酵母ALDH基因,PCR扩增后通过重组构建pNZ8048-ALDH表达载体,电转至乳酸乳球菌NZ9000感受态,Nisin诱导表达后经Ni柱亲和层析纯化ALDH蛋白,比色法测定酶活。结果:构建了pNZ8048-ALDH表达载体,在乳酸乳球菌NZ9000中实现了ALDH的重组表达,目的蛋白占全菌蛋白的17.2%,其中可溶性表达比例为53%,重组菌株ALDH活力为0.638 U/mL,亲和层析纯化蛋白纯度约70%,比活为0.48 U/mg。结论:在乳酸乳球菌中表达并纯化获得了有活性的ALDH。     

甲型副伤寒沙门菌PagC蛋白在乳酸乳球菌中的表达研究

目的构建能够表达甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白(Pag C)的乳酸乳球菌。方法 PCR扩增pag C基因,亚克隆至p MD18-T载体并测序,从亚克隆载体中酶切回收pag C基因,插入p MG36e并命名为p MG36e-pag C,转化乳酸乳球菌MG1363。溶菌酶加超声的方法破碎重组乳酸乳球菌,SDS-PAGE以及Western blot检测Pag C蛋白的表达。结果 p MG36e-pag C鉴定正确,Western blot检测到p MG36e-pag C/MG1363表达的Pag C蛋白。结论成功构建能组成型表达Pag C蛋白的乳酸乳球菌。     

重组乳酸乳球菌表达禽流感病毒HA1基因载体的构建及在禽流感病毒防治领域的应用

目的构建以重组乳酸乳球菌为基础的黏膜输送载体。方法以高致病性禽流感病毒H5N1的HA1基因作为研究对象,利用nisin诱导表达控制系统,构建分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体,经口服灌胃途径免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测小鼠血清IgG和粪便IgA,最后,对免疫后的小鼠进行H5N1病毒攻击实验,进而比较分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体的免疫效率。结果分泌型重组乳酸乳球菌免疫小鼠后产生的抗体水平（IgG和IgA）高于非分泌型重组乳酸乳球菌,经过同型H5N1病毒攻击后,分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为80%,而非分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为60%。结论本研究为防治高致病性禽流感病毒提供可行的思路与方法。     

乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立北大核心CSCD

参照甜味蛋白Brazzein基因序列,结合乳酸乳球菌的密码子偏嗜性的相关分析,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,将第29位天冬氨酸、31位的组氨酸和第41位的谷氨酸分别突变为赖氨酸、丙氨酸和赖氨酸,以期提高目的蛋白的甜度。采用重叠PCR的方法合成目的基因,目的片段亚克隆到pMD18-T载体上。经序列测定分析后,目的片段克隆入分泌表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌中,构建成表面展示表达甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表达系统。     

乳酸乳球菌表面表达Brazzein甜味蛋白系统的建立

参照甜味蛋白Brazzein基因序列,结合乳酸乳球菌的密码子偏嗜性的相关分析,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,将第29位天冬氨酸、31位的组氨酸和第41位的谷氨酸分别突变为赖氨酸、丙氨酸和赖氨酸,以期提高目的蛋白的甜度。采用重叠PCR的方法合成目的基因,目的片段亚克隆到pMD18-T载体上。经序列测定分析后,目的片段克隆入分泌表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌中,构建成表面展示表达甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表达系统。     

使用偏爱密码子大幅度提高苯丙氨酸脱氨酶在食品级乳酸乳球菌中的表达

为获得苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在食品级乳酸乳球菌中的高效表达,将欧芹palcDNA(palnat)及根据乳酸乳球菌偏爱密码子设计人工合成的pal基因(palart)重组并转化到两种乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中,测定基因工程菌表达PAL酶的量及活性,对比分析密码子偏爱性对乳酸乳球菌表达外源蛋白的影响。结果表明在两种乳酸乳球菌NICE表达系统中,使用偏爱密码子均可显著提高PAL酶的表达效率,使NZ9000/pNZ8048表达系统表达量提高22.23倍,NZ3900/pNZ8149系统提高35.90倍。此研究获得了安全高效表达PAL,可用于治疗苯丙酮尿症的基因工程菌。     

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因在乳酸乳球菌MG1363中的整合及表达

根据南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)的基因序列将CALB基因进行TA克隆、酶切鉴定及测序后,亚克隆至大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭表达栽体pMG36e-Nisl中,构建重组表达栽体pMG36e-Nisl-CALB.设计特异性引物P3和P4,对重组质粒pMG36e-NisI-CALB进行红霉素抗性基因的敲除,以构建食品级表达载体pMG36N-CALB,后再将两种重组质粒分别电转化入乳酸乳球菌MG1363,以Nisin为选择压力,考察CALB在MG1363中的表达情况.结果显示,成功构建了表达载体pMG36e-NisI-CALB及pMG36N-CALB,两株重组菌在含有20 IU Nisir/mL的培养基中均生长情况良好,遗传性能稳定,且经水解圈鉴定,CALB能够进行活性表达.进一步研究发现,CALB基因整合到乳酸乳球菌MG1363染色体中.     

表达增强绿色荧光蛋白重组乳酸菌的构建

以乳酸乳球菌通用表达载体pMG36e为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)插入该载体组成型表达强启动子p32的下游,构建了eGFP标记的乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP。重组质粒电击转化一株乳酸乳球菌BLCC02-0018。筛选阳性转化子,通过连续荧光强度检测,验证eGFP基因能否在重组菌中稳定表达。重组表达质粒pMG36e-eGFP酶切及测序结果与预期片段大小相符,表明成功构建了重组乳酸菌表达载体pMG36e-eGFP;对阳性转化子进行蓝光激发,可见明显的绿色荧光,且荧光稳定性强,连续传代30代仍可见荧光,结果表明已经成功构建表达增强型绿色荧光蛋白的重组乳酸乳球菌,为下一步研究乳酸菌在动物体内的分布定殖规律打下了基础。     

人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

以lacF基因为食品级选择标记,构建了乳酸乳球菌食品级基因表达系统,并进而实现了人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达。首先构建了含有lacF基因两侧同源DNA序列(0.5kb)的整合型质粒pUCEmDE,通过pUCEmDE与乳酸乳球菌MG5267染色体上单拷贝的乳糖操纵子之间的同源双交换,构建了lacF基因缺失突变的食品级受体菌WZ103 (Lac-),并经PCR及Lac表型检测所验证。然后构建了互补质粒pMG36eF,其lacF基因的表达受组成型的强启动子P32的控制。将其电转化导入WZ103后,Lac+表型得到恢复,表明WZ103中lacF基因的功能可被互补质粒pMG36eF上的lacF基因互补。随后,以互补质粒pMG36eF为基础,构建了不含任何抗生素抗性选择标记的人铜锌超氧化物歧化酶基因的食品级表达质粒pWZ104。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SOD活性凝胶染色分析,检测到WZ103(pWZ104)中Cu/Zn SOD的表达,并且具有生物活性。     

变形链球菌致龋抗原基因在乳酸乳球菌的表达

目的 克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中表达.方法 在实验中利用了分子克隆技术构建携带GbpB基因的重组原核表达质粒pNI1,将重组质粒转化乳酸乳球菌YF02株,筛选鉴定阳性菌落,诱导表达的GbpB蛋白用SDS-PAGE进行鉴定.结果 成功克隆了GbpB功能区的基因片段,并在乳酸乳球菌中得到其融合蛋白的表达.结论 利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得乳酸乳球菌融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.