低H~+_-ATPase活性植物乳杆菌突变菌筛选及基因表达的相对定量分析

【目的】筛选H~+_-ATPase活性降低的植物乳杆菌突变菌,比较其与亲本菌基因表达水平的差异,进一步探索H~+_-ATPase的调控机制。【方法】利用硫酸新霉素诱变、筛选突变菌,并对亲本菌(ZUST)和突变菌(ZUST-1、ZUST-2)进行生长、产酸能力及H~+_-ATPase活性的测定。分别提取亲本菌和突变菌的基因组DNA,扩增H~+_-ATPase全部编码基因并测序。通过荧光定量PCR对H~+_-ATPase全部编码基因进行相对定量分析。【结果】突变菌的生长和产酸能力均低于亲本菌,突变菌ZUST-1和ZUST-2的H~+_-ATPase活性比亲本菌分别降低了10.1%和28.8%。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A基因均有22个位点发生突变,而ZUST-2的atp C基因有6个位点发生突变。突变菌ZUST-1和ZUST-2的atp A在对数期基因表达水平分别比亲本菌ZUST下调了41.1%和35.7%,在稳定期分别下调了43.6%和14.2%;ZUST-1的atp C基因在对数期的表达水平比ZUST略高,在稳定期比ZUST上调了30%,而ZUST-2的atp C基因未表达。【结论】突变菌H~+_-ATPase活性减弱会导致其全部编码基因在稳定期表达水平上调(除ZUST-2的atp C不表达外),而且atp A和atp C基因突变导致的基因表达水平的差异是影响H~+_-ATPase活性的主要因素,此研究结果为进一步研究植物乳杆菌中H~+_-ATPase的调控机制奠定了基础。     

保加利亚乳杆菌H+-ATPase缺陷型菌株的筛选

【目的】从传统乳制品中筛选具有新霉素抗性的H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变株,为最终开发弱后酸化的酸奶发酵剂奠定基础。【方法】利用API 50 CH细菌鉴定系统和16s rRNA基因序列分析对菌株进行鉴定。新霉素作为筛选压力,筛选具有新霉素抗性自发突变菌株,比较亲本和突变菌株的H+-ATPase活力及其代谢情况。【结果】从内蒙古地区的传统发酵酸奶中分离鉴定出一株德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）,并命名为KLDS 1.9201。以此为出发菌株,筛选出两株H+-ATPase缺陷的自发突变株,分别命名为KLDS 1.9201-1、KLDS 1.9201-4,它们的H+-ATPase活力分别比亲本KLDS 1.9201降低了46%和60%。在MRS培养基中生长24 h后,KLDS 1.9201、KLDS 1.9201-1和KLDS 1.9201-4对初始葡萄糖的代谢率分别为65%、41%和31%,终产物中乳酸的浓度分别为26g/L、18g/L和15g/L,突变菌株的生物量均低于亲本。【结论】H+-ATPase活力降低的德氏乳杆菌保加利亚亚种的自发突变株具有较低的生长速率和弱产酸能力,它们可被用于制作弱后酸化的酸奶发酵剂。     

外源精氨酸对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖胁迫下生长和发酵特性的影响

【目的】探究外源添加不同氨基酸和相容性溶质对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)在高糖胁迫环境下生长的影响及可能的作用机理。【方法】通过在培养基中外源添加各种氨基酸和相容性溶质,研究其对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖和高蔗糖胁迫下生长的影响,并分析添加精氨酸对高葡萄糖胁迫下菌株糖转运和代谢途径中关键酶转录水平的影响,以及对菌株发酵产氨基酸的影响。进一步探究了碱性氨基酸在其它棒状杆菌属中抵御高葡萄糖胁迫的潜在作用。【结果】在高葡萄糖胁迫条件下,外源添加赖氨酸、精氨酸和组氨酸后谷氨酸棒杆菌的生物量分别提高54.7%、50.0%和37.6%;而在高蔗糖胁迫条件下,添加脯氨酸和四氢嘧啶后菌株生物量增加20%以上。进一步研究表明,在高葡萄糖胁迫下,外源添加精氨酸后谷氨酸棒杆菌的葡萄糖利用速率提高约2.5倍,谷氨酸的发酵产量也增加了127.5%。此外,碱性氨基酸对其它4种棒状杆菌也具有一定的渗透保护效应。【结论】精氨酸对谷氨酸棒杆菌在高葡萄糖胁迫下具有良好的渗透保护作用,可能归因于其能促进葡萄糖的转运和代谢能力,同时发现碱性氨基酸的渗透保护效应对棒状杆菌属具有一定的普遍性。     

缓慢干旱下春小麦叶片质膜脂肪酸组成、H~+-ATPase肥及5′-AMPase活力的变化

研究了田间缓慢干旱胁迫下,抗旱性不同的两个小麦(Triticum aestivum)品种的生长状况、质膜极性脂脂肪酸组成以及质膜关键酶活力的变化。在小麦生长发育的早期,干旱胁迫使其叶片质膜极性脂脂肪酸不饱和度下降、质膜微囊消耗O_2的速率升高、膜蛋白含量降低、H~+-ATPase(EC 3.6.1.35)活力下降、5′-AMPase(EC 3.1.3.5)活力大幅度升高;在小麦发育的后期,随着干旱的持续,小麦叶片质膜的极性脂脂肪酸不饱和度不变或升高、质膜微囊消耗O_2的速率降低、膜蛋白含量与H~+-ATPase活力升高、5′-AMPase活力下降。以上结果表明,小麦在发育的早期阶段对干旱较敏感,其细胞质膜流动性降低、细胞中能荷贮备降低;而在后期,则又表现出对干旱的适应。这些结果将有助于阐明自然干旱条件下植物的抗旱机制。     

基于转录组分析植物乳杆菌AR195在亚油酸胁迫下的生理响应

植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和共轭亚油酸（CLA,Conjugated linoleic acid）均具有良好的益生特性和保健功能。目前人们已经明确了植物乳杆菌CLA生物合成的途径，但仍然缺乏对底物亚油酸（Linoleic acid,LA）响应机制的研究。文章基于转录组学分析了LA对植物乳杆菌AR195生长和基因表达的影响，结果表明LA能够抑制AR195的生长，添加LA后AR195中157个基因上调，67个基因下调，差异表达基因在代谢、环境信息处理和细胞过程等KEGG通路中富集。LA毒性主要来自于生长抑制和氧化还原失衡，而AR195可通过维持氧化还原平衡、生物转化CLA、增强碳源摄取及代谢、全局转录调控等生理响应过程缓解LA毒性。文章首次提出植物乳杆菌AR195应对LA胁迫的分子机制，为植物乳杆菌对LA的应激响应及CLA合成的内在动因提供了新的见解。     

酸胁迫下琥珀酸放线杆菌的生理及转录应答

【目的】通过琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593对酸胁迫的生理应答和转录组学分析,探究琥珀酸放线杆菌酸胁迫的机制。【方法】测定不同pH对细胞生长、H+-ATPase、细胞内pH的影响;测定酸胁迫前后细胞膜和谷氨酸脱氢酶的变化、谷氨酸对琥珀酸放线杆菌生长的影响;通过RNA-seq测序分析酸胁迫条件下的差异表达基因。【结果】随pH值的降低,细胞生长受抑制,H+-ATPase的活性下降。pH 4.7酸胁迫后,细胞膜受到严重损伤,谷氨酸对酸胁迫后的细胞有保护作用,GDH酶活响应酸胁迫后略有增加。酸胁迫后,39个基因差异表达较为显著,其中49%基因属于应激蛋白、转运蛋白,小部分基因与代谢相关。【结论】本文探究了琥珀酸放线杆菌酸胁迫下的生理及转录应答,研究结果可为寻找增强琥珀酸放线杆菌耐酸性策略提供参考。     

鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因ldhD的敲除

聚乳酸由可再生原料L-乳酸合成,是目前应用的最环保的生物塑料之一。鼠李糖乳杆菌JCM1553中的L-乳酸和D-乳酸,它们是由代谢途径中的L-乳酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶分别催化丙酮酸而生成。L-乳酸的光学纯度对于L-乳酸的应用至关重要。因此,为了获取光学纯的L-乳酸,需要敲除该鼠李糖乳杆菌编码D-乳酸脱氢酶的基因ldhD以阻断相关的D-乳酸代谢途径。本研究采用pK18mobsacB自杀质粒运用重叠延伸PCR和同源重组技术成功构建得到重组鼠李糖乳杆菌菌株JCM1553-△ldhD。构建的缺失突变体JCM1553-△ldhD菌株没有引入外源基因,完全符合食品、药品安全要求,发酵液中检测到的L-乳酸含量为99.92%,光学纯度达到99.84%,显著优于野生型菌株。     

谷氨酸棒杆菌H+-ATPase基因失活提高谷氨酸产生量

为了证实在谷氨酸棒杆菌中,利用H⁺-ATPase基因失活构建高产谷氨酸基因工程菌的应用可行性,通过重组PCR技术部分缺失H⁺-ATPaseγ亚基基因序列,采用插入失活方法构建H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌。考察了其谷氨酸产生能力及对生长速率的影响。实验结果表明,H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌在含有100g/L的葡萄糖培养基中摇瓶发酵,其谷氨酸最大累积量为51.6g/L, 比野生菌株提高了42.9%。生长速率研究结果表明,H⁺-ATPase失活的谷氨酸棒杆菌生长速率略低于野生谷氨酸棒杆菌。证实了H⁺-ATPase基因失活对提高谷氨酸产量的作用,为利用H⁺-ATPase基因构建高产谷氨酸基因工程菌株提供了科学依据。     

过量表达烟酸转磷酸核糖激酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111厌氧发酵的主要产物为丁二酸,是发酵生产丁二酸的潜力菌株。但是由于敲除了乳酸脱氢酶的编码基因 (ldhA) 和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因 (pflB),导致辅酶NADH/NAD+不平衡,厌氧条件下不能利用葡萄糖生长代谢。构建烟酸转磷酸核糖激酶的重组菌Escherichia coli NZN111/pTrc99a-pncB,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加0.5 mmol/L的烟酸、0.3 mmol/L的IPTG诱导后重组菌的烟酸转磷酸核糖激酶 (Nicotinic acid phosphor     

拟南芥AtJ3通过核质转运调控植物质膜H~+-ATPase活性与ABA响应

拟南芥AtJ3(Arabidopsis thaliana Dna J homolog 3)为一蛋白分子伴侣,在植物体内可通过与PKS5(SOS2-like protein kinase 5)蛋白激酶形成复合物来抑制PKS5的活性;同时AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行正向调节,并参与对外源ABA的响应。为揭示AtJ3-PKS5复合物参与质膜H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应中的作用,本研究以拟南芥AtJ3、PKS5不同突变体为材料,在盐及ABA共同处理下对AtJ3-PKS5复合物的功能及作用机制进行了探讨。结果显示,在2种因素共同处理下,AtJ3-PKS5复合物可同时对处理因素进行响应。即AtJ3-PKS5复合物可对质膜上H~+-ATPase质子转运活性进行调节,并使细胞内p H值发生变化,同时还可诱导ABI5下游ABA响应基因的表达;外源ABA可引起AtJ3从细胞核向细胞质的转运,从而增强了AtJ3对H~+-ATPase活性的调节。说明AtJ3-PKS5复合物在对H~+-ATPase活性调节及对外源ABA响应的交互代谢途径中起着关键调节子的作用。     

植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因克隆与生物信息学分析

[目的]对植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶基因(lox)进行克隆及生物学信息学分析。[方法]PCR克隆lox基因,测序后采用多种生物学信息软件预测该基因对应蛋白的理化性质和结构特征。[结果]植物乳杆菌LY-78的乳酸氧化酶基因全长1 101 bp,编码366个氨基酸,其蛋白分子量38 730.1 Da,p I 5.58,亲水性非分泌蛋白。该蛋白氨基酸序列系统进化树分析表明,该基因序列保守性较高,可以反映近缘物种的亲缘关系;具有保守的α-羟基酸脱氢酶结合结构域。[结论]为揭示植物乳杆菌LY-78乳酸氧化酶的生理功能及在苯乳酸代谢机理中的作用提供了理论依据。     

多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定

【目的】构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,并验证其致病性。【方法】采用正向筛选同源重组技术构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,利用PCR对突变株进行鉴定,分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。【结果】成功构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,连续传代20代,遗传稳定;突变株体外生长曲线表明,在前6h生长速度稍慢于亲本菌,随后两者生长速度一致。对小鼠的致病性试验表明:经腹腔注射aroA基因缺失突变株在1.0×106 CFU对小鼠无致死性,而亲本菌株在1.0×102 CFU对小鼠是致死性的。【结论】本研究获得多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,对小鼠的致病性是减弱的。多杀性巴氏杆菌突变株的构建有助于研究其致病机理。     

不同浓度外源乙酸钠对耐乙酸大肠埃希菌DA19代谢和关键酶酶活的影响

为研究外源乙酸钠对大肠埃希菌DA19生长代谢的影响,将该菌株在氮源限制基本培养基及添加不同浓度乙酸钠的氮源限制基本培养基中连续培养,测定稳态时生长代谢参数和胞内关键酶酶活。与MN培养基相比,葡萄糖比消耗速率和延胡索酸比生成速率随外源乙酸钠质量浓度增加而逐渐下降,丙酮酸比生成速率则随外源乙酸钠质量浓度增加而明显增加,而乙酸比生成速率则明显降低(除9 g/L乙酸钠外)。磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和乙酸激酶酶活随外源乙酸钠质量浓度增加而呈先下降后上升的趋势,而6-磷酸葡萄糖脱氢酶则随着外源乙酸钠质量浓度增加而逐渐降低。为了应对外源乙酸钠压力,大肠埃希菌DA19的生长代谢和中心代谢途径酶活都发生了明显改变。     

过量表达烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶对大肠杆菌NZN111产丁二酸的影响

大肠杆菌NZN111是敲除了乳酸脱氢酶的编码基因(ldhA)和丙酮酸-甲酸裂解酶的编码基因(pflB)的发酵生产丁二酸的潜力菌株。厌氧条件下NADH不能及时再生为NAD+,引起胞内辅酶NAD(H)的不平衡,最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖生长代谢。nadD为催化NAD(H)合成途径中烟酸单核苷酸(NaMN)生成烟酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)的烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶(Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase,NAMNAT)的编码基因,通过过量表达nadD基因能够提高NAD(H)总量与维持合适的NADH/NAD+比例。文中构建了重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD,在厌氧摇瓶发酵过程中通过添加终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,重组菌E.coli NZN111/pTrc99a-nadD中NAD+和NADH的浓度分别比宿主菌E.coli NZN111提高了3.21倍和1.67倍,NAD(H)总量提高了2.63倍,NADH/NAD+从0.64降低为0.41,使重组菌株恢复了厌氧条件下生长和代谢葡萄糖的能力。重组菌与对照菌相比,72 h内可以消耗14.0 g/L的葡萄糖产6.23 g/L的丁二酸,丁二酸产量增加了19倍。     

嗜乙酰乙酸棒杆菌Corynebacterium acetoacidophilum-Δldh缺氧条件下代谢葡萄糖途径的变化

缺氧条件下嗜乙酰乙酸棒杆菌Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870生长停滞,却能够代谢葡萄糖产生以乳酸和琥珀酸为主的有机酸。采用以sacB基因为反向筛选标记的同源重组染色体基因敲除系统,敲除嗜乙酰乙酸棒杆菌的乳酸脱氢酶基因,得到的Δldh菌株CCTCC NO.M20122041在缺氧条件下不产乳酸,葡萄糖消耗速率降低了29.3%,产琥珀酸和乙酸浓度分别提高45.6%和182%;NADH/NAD+值小于1(约0.7);磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和乙酸激酶的比酶活分别提高84%和12倍。说明嗜乙酰乙酸棒杆菌中乳酸合成途径的阻断驱使了琥珀酸和乙酸代谢途径加强,推测加强NADH供给和阻断乙酸产生支路可能是提高C.acetoacidophilum菌株产琥珀酸产量的有效途径。     

木棉花对乳酸菌生长及保存活力的影响

通过实验研究木棉花对与人类关系密切的植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、嗜热链球菌的生长及保存活力的影响。结果表明:木棉花对植物乳杆菌和两歧双歧杆菌的生长及保存活力有较大促进作用,而且此促进作用随着木棉花浓度的增大而增大。木棉花对嗜热链球菌的生长和保存活力的促进作用很小。因此,可考虑将木棉花适当添加到含有植物乳杆菌、两歧双歧杆菌的食品中,用以促进菌体的生长及保存活力,还可考虑利用木棉花制微生态制剂。     

钒酸钠、叠氮钠对小麦根细胞K~+吸收和质膜K~+-Mg~(2+)-ATPase的作用

Neurospora细胞膜质子泵(H~+-ATPase)专一性抑制剂钒酸钠,抑制小麦离体根K~+的吸收与H~+分泌,并抑制小麦根细胞膜-K~+-Mg~(2+)-ATPase活力。它对K~+吸收的抑制效应,可能是抑制质膜K~+-Mg~(2+)-ATPase活力的结果。而且在起抑制作用的时间上有明显地不同,表明钒酸钠对K~+、H~+在细胞膜中的通道影响不同。叠氮钠解链小麦根的呼吸,降低根细胞的ATP水平,但从实验开始就完全抑制小麦根K~+的吸收,对质膜K~+-Mg~(2+)-ATP-ase的活力没有影响。可能叠氮钠只阻止“载体”对K~+接受的过程。应用~86R_b+示踪的K~+吸收试验表明,钒酸钠对小麦根K~+吸收的抑制%,不为增加外部溶液K~+浓度而减低。增加底物ATP浓度,也不能减低钒酸钠对质膜-ATPase的抑制%。钒酸钠的抑制作用是非竞争性抑制。~3H-亮氨酸渗入试验表明钒酸钠对“载体”的合成没有干扰作用。VO_4~(3-)离子明显促进小麦根的呼吸,并提高根细胞的ATP水平,这种ATP水平的提高,可能是质膜-ATPase受到抑制,主动运输过程减弱的结果。     

外源钙对根际低氧胁迫下黄瓜幼苗ADH、LDH活性和同工酶的影响

以‘新泰密刺’黄瓜为材料,采用营养液栽培,外源使用Ca2+、钙离子通道抑制剂La3+与钙调素拮抗剂三氟拉嗪(TFP),研究了钙对根际低氧胁迫下黄瓜幼苗根系ADH、LDH活性和同工酶的影响。结果表明,低氧胁迫诱导产生了新的ADH和LDH同工酶条带。低氧胁迫下,ADH、LDH同工酶丰度和活性显著高于对照;外源增施Ca2+有利于Ca2+信号的形成和逆境信号的传递,营养液添加CaCl2缓解了低氧胁迫对黄瓜植株的伤害,ADH、LDH同工酶丰度和活性接近对照水平;La3+抑制Ca2+的吸收和体内运输,营养液添加LaCl3显著抑制了ADH和LDH同工酶丰度和酶活性,黄瓜幼苗植株生长受到抑制,生物量显著低于低氧处理,表明La3+加重了低氧胁迫对黄瓜幼苗植株的伤害;TFP抑制了低氧逆境胁迫信号的传递,营养液添加TFP抑制了ADH和LDH同工酶丰度和酶活性,ADH和LDH同工酶丰度和酶活性显著低于低氧处理,黄瓜幼苗植株生长受到抑制,黄瓜植株的低氧耐性降低。暗示外源Ca2+参与了低氧胁迫下黄瓜根系无氧呼吸代谢的调节,增强了Ca2+向植物体内的运输,缓解了低氧胁迫对黄瓜幼苗植株的伤害,增强了植物对低氧的耐性。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵特性的研究

在添加5%(v/v)番茄汁的改良配方乳中对植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌或与嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌混合发酵的生长特性、发酵乳风味进行了研究.结果表明,在脱脂乳中添加5%(v/v)番茄汁可以明显缩短植物乳杆菌ST-Ⅲ单菌发酵时的凝乳时间,提高其活菌数.在改良的配方乳中,三菌混合发酵制备的发酵乳具有良好的酸奶风味、无涩味.但与...     

不同生长时期鼠疫耶尔森菌调控子Fis转录谱的比较分析

目的:进行不同生长时期鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)野生株和fis突变株转录谱的比较分析。方法:基于Red重组系统缺失替换鼠疫菌的fis基因;用鼠疫菌全基因组DNA芯片转录谱技术,比较不同生长时期鼠疫菌野生株和fis突变株在转录水平上的差异;用实时定量RT-PCR对转录谱结果进行验证。结果:构建了鼠疫菌fis::Km突变株,芯片杂交数据与RT-PCR验证的比较结果表明二者有较高的相关性,相关系数r=0.93。结论:无论生长对数期还是稳定期,Fis都能够激活或抑制鼠疫菌一些重要基因的转录,如Ⅲ型分泌系统效应蛋白编码基因、psaAB、pla、rovA等,表明Fis可能与其他调控子一起,在鼠疫菌的代谢及毒力因子转录的协调控制上起关键作用。