牛樟芝固态发酵成分缓解L-O2细胞酒精损伤的研究

牛樟芝谷物固态发酵可产生多种生物活性成分,是具有良好应用潜力的培养方式。本文以牛樟芝青稞固态发酵物为原料,通过硅胶柱层析获得4种生物活性成分,然后利用人正常肝细胞L O2酒精损伤模型对这4种活性成分进行功能评价。研究结果显示,酒精损伤能够导致L O2细胞收缩,贴壁能力减弱。在所研究的4种活性成分中,AdA和Aq均能够有效抑制L O2细胞形态变化并增强细胞的贴壁性能。进一步分析发现,这些活性成分能够通过提高肝细胞抗氧化能力缓解酒精性损伤,其中AdA和Aq具有较好的抗肝损伤能力,能显著降低细胞培养液中ALT(Alanine transaminase,谷丙转氨酶)和AST(Aspertate aminotransferase,谷草转氨酶)的活力,显著降低细胞中MDA(Molondialdehyde,丙二醛)的含量,并提升SOD(Super oxide dismutase,超氧化物歧化酶)和GSH(Glutathione,谷胱甘肽)的含量。本文为研究牛樟芝固态发酵产物缓解酒精性肝损伤机制奠定了基础。     

牛樟芝多糖对HepG2细胞酒精性氧化损伤的保护作用

研究了不同剂量（100、200和400μg/mL）的牛樟芝粗多糖（CP）和醇提物后的水提物（WEE）对酒精诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用。研究结果表明：与模型组比较,各剂量组的CP和200、400μg/mL的WEE均能极显著提高HepG2细胞的细胞活力。100μg/mL的CP和WEE均能极显著降低细胞培养液的ALT水平;200和400μg/mL的CP和WEE均能显著降低细胞培养液的ALT、AST水平,同时提高胞内的CAT活力;200和400μg/mL的WEE及400μg/mL CP能明显提高胞内的SOD活力。此外,WEE各剂量组和400μg/mL CP中的胞内ROS水平显著下降。CP中含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖5种单糖,摩尔比为1:0.1622:6.651:2.646:0.3929。WEE和CP能提高细胞的抗氧化应激能力,降低胞内ROS,对酒精诱导的HepG2细胞氧化损伤起到明显的保护作用,提示多糖是牛樟芝解酒保肝的重要活性成分之一。     

玉竹多糖对酒精诱导的HepG2细胞损伤的保护作用及其机制*

目的: 探究玉竹多糖对酒精诱导HepG2细胞损伤的保护作用及潜在的分子机制。方法: 通过噻唑蓝(MTT)法筛选酒精处理HepG2细胞的合适浓度和玉竹多糖干预浓度后,将HepG2细胞按照不同干预浓度(200 μg/L、400 μg/L和600 μg/L)的玉竹多糖分组,并设未添加玉竹多糖的空白组,预处理1 h后,再用4%酒精处理24 h,每组设置3个复孔,检测细胞内丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性,检测细胞内活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,检测细胞Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、磷酸化核因子E2相关因子 2(p-Nrf2)、磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化还原酶-1(NQO1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase-3)蛋白表达。结果: 与4%酒精处理后的HepG2细胞对比,各浓度玉竹多糖的干预能有效下调酒精诱导HepG2细胞内ALT和AST活性(P＜0.05);200 μg/L浓度玉竹多糖组的IL-1β和TNF-α水平明显下降(P＜ 0.05),而GSH水平明显上升(P＜0.01);400 μg/L和600 μg/L浓度玉竹多糖组的ROS、MDA、IL-1β和TNF-α水平明显下降(P＜0.05或P＜ 0.01),而GSH水平明显上升(P＜0.01)。玉竹多糖在有效上调酒精诱导HepG2细胞内p-Nrf2和NQO1蛋白表达的同时也下调Bax/ Bcl-2指数(P＜0.05),抑制Keap1和cleaved-caspase-3蛋白表达(P＜0.05)。结论: 玉竹多糖能通过调控Nrf2/ Keap1通路改善酒精诱导HepG2细胞氧化应激损伤,从而降低HepG2细胞炎症指数和细胞凋亡水平,其中400 μg/L和600 μg/L玉竹多糖的干预效果较好。     

GFER抑制四氯化碳对HepG2细胞的损伤

目的探讨HepG2细胞内生长因子ERV1样基因(growth factor Erv1-gene,GFER)表达降低后对四氯化碳(CCl4)诱导的细胞损伤的影响,以进一步明确GFER对于肝细胞的保护作用。方法首先将GFER siRNA转染入HepG2细胞,72 h后收集细胞并通过Western Blot检测GFER的表达以明确沉默效率。再次将GFER siRNA转染入HepG2细胞72 h后,用CCl4处理细胞6 h和24 h,检测细胞内ATP的含量,caspase-3的活性,并应用MTS方法测定细胞的增殖能力以及TUNEL方法检测细胞凋亡。结果 Western blot结果显示转染GFER siRNA后细胞内GFER的表达降低。CCl4处理细胞6 h后,GFER表达降低使细胞的增殖能力下降,细胞内ATP含量增加,细胞凋亡更为明显。CCl4处理24 h后,GFER表达降低使细胞的增殖能力进一步下降,Caspase 3活性进一步升高,凋亡细胞数目显著增多,而ATP的含量明显下降。结论 GFER表达降低促进CCl4对HepG2细胞的损伤。     

基于重组HepG_2-P4503A4与HepG_2-P4503A46全细胞体外药物代谢比较研究

本研究以探针药物硝苯地平(NF)、睾酮(TST)及其抑制剂酮康唑(KCZ)与重组HepG2-P4503A4、HepG2-P4503A46细胞全细胞在优化的重组细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将二者进行比较分析。重组HepG2-P4503A46与HepG2-P4503A4细胞的硝苯地平、睾酮的代谢活性无显著差异(P0.05);在0~10μM的浓度范围内,酮康唑对硝苯地平和睾酮的抑制活性均随酮康唑浓度的增加而增加,且其IC50值均低于1μM,为nM级,表明酮康唑对二者的硝苯地平代谢具有较强的抑制活性,抑制剂酮康唑对重组HepG2-P4503A46与HepG2-P4503A4细胞的抑制活性差异不显著(P0.05)。本研究表明无论是底物代谢或底物抑制活性,重组HepG2-P4503A46细胞均与重组HepG2-P4503A4细胞差异不显著,P4503A46可能为巴马小型猪体内人P4503A4的同源酶。     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞侵袭的影响

目的研究HBV全长对HepG2细胞侵袭相关基因表达及活性的影响,探讨HBV在整体水平对HepG2细胞侵袭的影响。方法采用定量PCR分析HBV对HepG2细胞MMP2、9和TIMP1-4基因转录的影响;通过明胶酶谱及反相明胶酶谱检测MMP2、MMP9及TIMPs的活性;应用体外侵袭小室法检测细胞的侵袭能力。结果HBV的复制可以促进HepG2细胞MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP3基因的转录,抑制TIMP4基因转录,增强HepG2细胞MMP2、MMP9的活性并增强细胞中TIMP1、TIMP3功能,HBV稳定复制的细胞具有更强的体外侵袭能力。结论HBV可影响HepG2细胞MMPs和TIMPs的基因转录、表达及功能,促进HepG2细胞的体外侵袭,这可能与HBV相关的HCC侵袭转移密切相关。     

杆状病毒用于哺乳动物细胞快速高效表达外源基因的研究

现已发现杆状病毒可进入某些培养的哺乳动物细胞,这提示可将杆状病毒作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体。对杆状病毒转移载体的改造及对哺乳动物细胞的基因转移方式进行了进一步的研究。以绿色荧光蛋白基因为报告基因,利用Bac-to-Bac系统构建了分别含有正向和反向CMV启动子表达盒的两种重组杆状病毒。可观察到CMV启动子在Sf9细胞中可启动报告基因的表达,但表达效率较低。用重组杆状病毒感染后Sf9细胞的培养上清直接与HepG2细胞作用,以流式细胞术检测基因转移效率及荧光表达强度,发现这两种病毒在相同的感染复数下对HepG2细胞具有相似的基因转移及表达效率。同时,利用流式细胞术进一步研究了直接使用重组杆状病毒感染4d后Sf9细胞的培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的方法。通过对HepG2细胞的实验结果显示,将带毒Sf9细胞培养上清(1.2×10⁷PFU/mL)用哺乳动物细胞培养基1倍稀释后,37℃下孵育靶细胞12h(moi=50),可达到较高的基因转移及表达效率,同时不会对细胞造成明显损伤。将重组杆状病毒与脂质体和逆转录病毒这两种系统对HepG2及CV1细胞的基因转移效率进行了比较,结果发现在同样未经浓缩等特殊处理的条件下重组杆状病毒对这两种细胞的基因转移效率是最高的。因此可以认为,经过适当改造后的Bac-to-Bac重组杆状病毒系统可作为一种对哺乳动物细胞简便高效的基因转移表达载体。     

珊瑚树Vibsane型二萜类化合物对人体HepG2细胞增殖的影响及其机制

目的：探讨珊瑚树vibsane型二萜类化合物对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制,为研发新型天然植物类抗肿瘤药物提供实验依据。方法：采用噻唑蓝比色法及苔盼蓝染色计数法观察珊瑚树vibsane类二萜类化合物对不同肿瘤细胞增殖的影响;应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡,利用Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7试剂盒检测vibsane二萜类化合物1#对HepG2细胞内Caspase-3酶活性的影响。结果：活性筛选发现vibsane型二萜类化合物1#显著抑制人肝癌HepG2细胞增殖,构效分析表明化合物C11位连接侧链的基团修饰影响其细胞增殖抑制活性。此外,HepG2细胞对1#化合物最敏感,1#化合物抑制其增殖具有剂量和时间依赖性。机制研究显示1#化合物诱导HepG2细胞发生明显的细胞周期G0/G1期阻滞,具有时间和剂量效应;同时,较高浓度1#化合物（5-10μmol/L）引起HepG2细胞凋亡明显增加,并剂量依赖性诱导细胞内Caspase3/7激活。结论：珊瑚树vibsane型二萜类化合物能够明显抑制人肝癌HepG2细胞增殖,其可能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。     

饱和脂肪酸诱导肝细胞系建立代谢相关脂肪性肝病细胞损伤模型

摘要 目的：探讨不同脂肪酸对肝细胞系脂质积累、细胞损伤的影响,选择合适诱导试剂及肝细胞系建立一种具有严重细胞损伤及炎症反应的晚期代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）体外细胞模型。方法：以油酸（OA）或棕榈酸（PA）或其混合物分别处理HepG2和LO2细胞,以CCK8检测细胞存活率;以油红O染色及甘油三酯酶法检测细胞脂质积累程度;以qRT-PCR检测凋亡相关蛋白、纤维化相关蛋白、自噬相关蛋白、炎症因子的mRNA表达水平。结果：0.25 mmol/LPA作用HepG2细胞24 h可显著诱导甘油三酯（TG）和脂质积累,但对LO2细胞无明显影响;0.25 mmol/L PA处理两种细胞系可诱导显著的细胞损伤及炎症,OA可缓解PA对细胞的损伤作用。结论：利用PA处理HepG2细胞可引起一定程度的脂质积累,诱导显著的细胞损伤及炎症,是合适的MAFLD体外细胞模型。     

HBV影响XRN2基因在HepG2-H7细胞中表达的机制研究

目的利用稳定表达HBV的HepG2-H7细胞,研究HBV对XRN2基因表达的调控,并对其作用机制进行初步探讨。方法用RT—PCR和Real-time PCR的方法检测HepG2细胞及稳定表达HBV的HepG2-H7细胞中XRN2在mRNA水平的表达差异。构建XRN2启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒,分别转染HepG2细胞及HepG2-H7细胞,检测HBV对XRN2启动子的影响。将XRN2启动子质粒与HBV4种蛋白的真核表达质粒共转染HepG2细胞,寻找对启动子影响较大的HBV蛋白。结果RT—PCR和Real-time PCR的结果显示XRN2在HepG2-H7细胞中的表达较HepG2细胞有所下降。荧光素酶活性分析显示HBV能抑制XRN2启动子的活性,且HBx和HBp蛋白在这一过程中起主要作用。结论HBV蛋白可以通过抑制XRN2启动子活性调节其在HepG2-H7细胞中的表达。     

一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法研究

目的探讨一种牛樟芝深层发酵复方制品的制备方法。方法选择以茯苓粉、山药粉、葛根粉、蜂花粉、大豆粉等原料配制深层发酵培养基,经深层发酵培养富含牛樟芝多糖的牛樟芝菌丝体发酵液,与采用超临界CO2技术提取、酶解、分离、过滤、浓缩制得的佛手、黄精、枸杞、砂仁、余甘子、枳椇子等中草药提取液复合。结果配制为一种牛樟芝深层发酵复方制品。结论该方法优化了牛樟芝多糖等活性成分的含量,具有产量高、时间短、成本低,可以工业化生产,而且高效环保,具有开发应用前景。     

黑木耳多糖结构分析及其保护肝细胞氧化损伤活性

为确定黑木耳多糖的结构特征及其体外保护肝细胞氧化损伤活性,通过破壁提取法、Sevag法、透析法对黑木耳子实体多糖(AHP)进行了分离纯化,采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)、离子色谱(IC)和红外光谱(IR)法对黑木耳多糖进行了分子质量、单糖组成及特征官能团分析;建立肝细胞氧化损伤模型,对AHP的肝保护活性进行了研究。结果表明:AHP糖含量为83.879%,分子质量410.3 kD,主要由岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)按2.240∶0.692∶3.994∶22.754∶65.696摩尔比组成的β型吡喃糖。H2O2损伤人肝癌细胞HepG2细胞中加入AHP后发现,AHP可抑制受损细胞发生的细胞核皱缩和边缘羽化现象;提高损伤细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶活性;减少一氧化氮(NO)等氧化产物生成量。AHP具有保护肝细胞氧化损伤的活性,具有将其进一步开发为保肝健康食品的潜力。     

p100蛋白表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立

目的建立p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株,并初步探讨p100在HepG2肝癌细胞中的功能。方法用脂质体将含有真核细胞筛选标记Neo和GFP的p100 shRNA表达质粒转染入HepG2细胞。经G418耐药筛选稳定整合抗药基因的细胞单克隆;荧光镜检GFP阳性细胞单克隆,挑取单克隆;Western检测HepG2细胞稳定株HepG2（p100I）中p100表达的抑制效果;平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;MTS法检测细胞存活;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得了p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株HepG2（p100I）,其中p100的表达明显降低。并且实验表明,该p100表达抑制稳定株的克隆形成能力,抵抗化疗药物Cisplatin诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞。结论p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立为研究p100蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模型,基于此稳定株的研究,发现p100能够影响HepG2肝癌细胞的多种细胞功能。     

粗毛纤孔菌子实体与菌丝体粗多糖改善小鼠急性酒精肝损伤的比较研究

粗毛纤孔菌是一种常见的药用真菌,具有医疗保健价值,多糖作为其主要活性成分之一,在生物活性中发挥着重要的作用。本文从粗毛纤孔菌子实体和菌丝体中提取了多糖成分,探讨了子实体多糖（IHFPS）和菌丝体多糖（IHMPS）对小鼠急性酒精肝损伤的保护作用。采用灌胃的方式给予C57BL-6小鼠多糖,连续灌胃3周,最后一次给药4h后,给予乙醇造成小鼠急性酒精肝损伤,通过记录小鼠醉酒、醒酒的时间,测定血清和肝脏相关生理生化指标以及病理切片来评价子实体和菌丝体多糖对急性酒精肝损伤小鼠的作用效果。结果表明,子实体与菌丝体多糖均能够显著延长小鼠的醉酒时间和缩短醒酒时间（P<0.05）,并降低了由酒精引起的肝指数、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和丙二醛（MDA）的升高,提高了乙醇脱氢酶（ADH）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性,病理切片结果进一步证实了子实体多糖与菌丝体多糖可以减轻由酒精引起的细胞损伤,总体来说,子实体多糖比菌丝体多糖对急性酒精损伤小鼠的保护作用更强。该研究表明了粗毛纤孔菌子实体与菌丝体多糖对急性酒精肝损伤小鼠具有一定的保护作用,研究结果丰富了粗毛纤孔菌多糖的药理药效,为其功能食品的开发提供了新思路。     

蛹虫草MF27菌糠多糖对肝细胞氧化损伤的保护作用

蛹虫草是一种可利用大米、小麦等谷物培育的名贵药用真菌,其采收后的菌糠里仍富含许多生物活性物质。本研究立足于蛹虫草菌糠多糖,先分析其化学抗氧化活性,再以H₂O₂诱导氧化应激损伤的LO2细胞为模型,评价其对肝细胞氧化损伤的保护作用,进而解析活性多糖的单糖组分。结果显示,菌糠多糖能够有效清除DPPH自由基、羟基（?OH）自由基和ABTS自由基,EC₅₀分别为0.26mg/mL、1.03mg/mL、0.57mg/mL,提示其具有良好的抗氧化能力;在H₂O₂诱导氧化应激损伤的LO2细胞中,菌糠多糖能有效地保护细胞形态的完整性,并且随浓度梯度递增式地提高细胞存活率,当多糖浓度为5mg/mL时,细胞存活率可达91.83%;在分析其作用机制上,与模型组对比,菌糠多糖能通过调节细胞抗氧化酶SOD（提高4.91倍）和CAT（提高3.40倍）的表达来清除ROS含量（P<0.01）,降低氧化损害;经检测,虫草菌糠活性多糖主要含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖醛酸、鼠李糖和岩藻糖等单糖。研究结果表明蛹虫草MF27菌糠多糖具有保护肝细胞氧化损伤的作用,为进一步开发和利用虫草菌糠提供了重要理论依据。     

NF-kB 拮抗剂PDTC 对HepG2 细胞的抑制及对caspase-3 表达的影响

目的:研究NF-kB拮抗剂PDTC诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对凋亡相关基因caspase-3表达的影响,初步探讨其诱导凋亡的可能机制。方法:以不同浓度的PDTC处理人肝癌HepG2细胞,利用MTT法检测对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响;利用RT-PCR和Western-blot检测caspase-3mRNA和蛋白的表达。结果:不同浓度PDTC作用人肝癌HepG2细胞不同时间后,能够显著抑制HepG2细胞的生长增殖,存在剂量和时间依赖性(P<0.05);PDTC能够上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。结论:NF-kB拮抗剂PDTC对人肝癌HepG2细胞产生显著抑制,并能上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

NF-kB拮抗剂PDTC对HepG2细胞的抑制及对caspase-3表达的影响

目的：研究NF-kB拮抗剂PDTC诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对凋亡相关基因caspase-3表达的影响,初步探讨其诱导凋亡的可能机制。方法：以不同浓度的PDTC处理人肝癌HepG2细胞,利用MTT法检测对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响;利用RT-PCR和Western-blot检测caspase-3mRNA和蛋白的表达。结果：不同浓度PDTC作用人肝癌HepG2细胞不同时间后,能够显著抑制HepG2细胞的生长增殖,存在剂量和时间依赖性（P〈0.05）;PDTC能够上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。结论：NF-kB拮抗剂PDTC对人肝癌HepG2细胞产生显著抑制,并能上调HepG2细胞中caspase-3mRNA和蛋白的表达。     

纳米氧化铈负载槲皮素引起人肝癌细胞自噬阻断

稀土氧化物纳米材料的生物安全性越来越受到关注,这类纳米材料引起的自噬反应对于癌细胞杀伤也具有重要意义。自噬在细胞存活和死亡中发挥双重作用,槲皮素可以促进自噬,稀土氧化物已被证明可引起不同类型的自噬。制备了葡聚糖包被的氧化铈纳米颗粒负载的槲皮素复合材料DCQ,并对其自身性质进行表征,从细胞活力及氧化损伤以及自噬、凋亡机制这几个方面研究了其对人肝癌细胞HepG2的作用。结果表明,此复合材料对HepG2细胞具有更强的毒性(P＜0.05),并且对正常细胞人脐静脉血管内皮细胞HUVEC无明显毒害作用,复合材料能够诱发人肝癌细胞产生大量活性氧,引起自噬阻断和诱导癌细胞凋亡。上述结果说明,这种纳米复合材料能有效杀伤人肝癌细胞,为肝癌治疗提供了新思路。