活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为

人类抗原R(human antigen R,HuR)是一种多功能RNA结合蛋白,参与细胞应激颗粒(stress granules,SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该研究是利用光漂白荧光损失(fl uorescence loss in photobleaching,FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋白颗粒进行应激动力学分析。首先,利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,以Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fl uorecent protein,RFP)标记;然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒,分别监测同一漂白细胞内的其他HuR颗粒以及核内荧光信号,并以邻近的未漂白细胞作为对照组。实验结果表明,转染重组质粒后可有效表达RFP-HuR融合蛋白,且与SGs标记蛋白G3BP存在共定位关系。在第一个光漂白循环,漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.;而经过约12个漂白循环(240 s)后,邻近HuR颗粒的荧光密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右,表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动态性;而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右,表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白,在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应激动力学属性,有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。     

p100蛋白表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立

目的建立p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株,并初步探讨p100在HepG2肝癌细胞中的功能。方法用脂质体将含有真核细胞筛选标记Neo和GFP的p100 shRNA表达质粒转染入HepG2细胞。经G418耐药筛选稳定整合抗药基因的细胞单克隆;荧光镜检GFP阳性细胞单克隆,挑取单克隆;Western检测HepG2细胞稳定株HepG2（p100I）中p100表达的抑制效果;平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;MTS法检测细胞存活;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得了p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株HepG2（p100I）,其中p100的表达明显降低。并且实验表明,该p100表达抑制稳定株的克隆形成能力,抵抗化疗药物Cisplatin诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞。结论p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立为研究p100蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模型,基于此稳定株的研究,发现p100能够影响HepG2肝癌细胞的多种细胞功能。     

针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析

目的：针对人Tudor-SN蛋白T103位点（103位苏氨酸,Thr103）制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法：首先人工合成含磷酸化T103（pT103）位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并利用Western blotting和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗pT103抗体进行鉴定;最后以In-cell Western法进行Tudor-SN蛋白的应激磷酸化/去磷酸化时相性分析。结果：（1）确定并合成磷酸化多肽“TIENKpTPQGRC”,收集约75 ml兔源抗血清,纯化后获取2.08 mg/ml抗pT103抗体;（2）当HeLa细胞受到氧化应激时,以pT103抗体检测的磷酸化信号增强,可在胞浆中检测到颗粒状信号,与内源性Tudor-SN应激颗粒存在共定位关系;（3）在氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论：成功制备针对Tudor-SN蛋白T103位点的兔源多克隆抗pT103抗体,有助于从磷酸化修饰角度进行Tudor-SN在细胞应激方面的机制探讨。     

泛素样蛋白UBQLN2通过抑制结肠癌Wnt信号通路发挥抑癌作用

结肠癌是一种危害人类健康的消化道肿瘤,结肠癌复杂的发病机制导致患者治疗效果不佳。泛素样蛋白质2(ubiquilin,UBQLN2)是泛素样蛋白质家族成员之一,参与调控细胞内蛋白质泛素化降解、内质网应激和溶酶体稳态,但是,其在结肠癌中的作用和机制目前尚不清楚。本研究旨在分析UBQLN2在结肠癌中的作用及其与经典促癌Wnt信号通路之间的关系。免疫组化和Western 印迹分析结果显示,UBQLN2在结肠癌组织和细胞中表达下调(P<0.05),UBQLN2与结肠癌转移以及临床分期呈显著负相关关系(P<0.05)。CCK-8和流式细胞术检测结果显示,抑制UBQLN2可促进结肠癌细胞增殖,抑制细胞凋亡(P<0.05)。免疫荧光和Western印迹结果显示,抑制UBQLN2可促进Bcl-2,抑制Bax表达,激活Wnt信号通路(P<0.05)。综上所述,泛素样蛋白UBQLN2通过抑制结肠癌细胞Wnt信号通路发挥抑癌作用。     

梯棱羊肚菌类膨大素蛋白Cerato-Platanin (CP)生物信息学分析及原核表达

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种珍稀食药用菌,经济价值极高,但其生活史及子实体发育过程并未完全明确,栽培技术尚不稳定.通过查阅文献和比对梯棱羊肚菌基因组信息,找到2个Cerato-platanin(CP,类膨大素)家族的基因,分别命名为Mi-CP1与Mi-CP2.采用生物信息学方法分析了Mi-CP1和Mi-CP2蛋白的结构及理化性质,构建了系统发育树,并采用qRT-PCR检测Mi-CP1和Mi-CP2基因在菌丝期、白菌核期、黄菌核期、原基期、幼菇期、成熟子囊果期6个不同生长发育阶段的相对表达量.结果 显示:Mi-CP1仅在菌丝期显著表达,而Mi-CP2在原基期和幼菇期大量表达,其中原基期是幼菇期的4.7倍,表明Cerato-platanin(CP)蛋白不仅与梯棱羊肚菌的营养生长有关,还可能参与了子囊果的发育.通过去除信号肽,分别构建pMAL-c2X-CP1X和pMAL-c2X-CP2X的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达,结果仅Mi-CP1X蛋白成功诱导表达,而Mi-CP2X蛋白未能成功诱导表达,推测可能与使用的表达载体有关.本研究为揭示CP蛋白在羊肚菌生长发育过程中的作用奠定了基础.