活细胞内人AGTR1-3′UTR的荧光标记及应激定位分析

利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA之间的高度亲和力,对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensin II receptor type 1,AGTR1)mRNA 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段进行红色荧光标记,进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3′UTR和24×MS2,构建重组质粒pSG5/AGTR1-3′UTR/24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示,AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒。该结果表明,针对AGTR1-3′UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3′UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3′UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。     

p100蛋白表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立

目的建立p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株,并初步探讨p100在HepG2肝癌细胞中的功能。方法用脂质体将含有真核细胞筛选标记Neo和GFP的p100 shRNA表达质粒转染入HepG2细胞。经G418耐药筛选稳定整合抗药基因的细胞单克隆;荧光镜检GFP阳性细胞单克隆,挑取单克隆;Western检测HepG2细胞稳定株HepG2（p100I）中p100表达的抑制效果;平板细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;MTS法检测细胞存活;划痕实验检测细胞迁移能力。结果成功获得了p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株HepG2（p100I）,其中p100的表达明显降低。并且实验表明,该p100表达抑制稳定株的克隆形成能力,抵抗化疗药物Cisplatin诱导的细胞死亡的能力和迁移能力明显低于对照组细胞。结论p100表达抑制的HepG2肝癌细胞稳定株的建立为研究p100蛋白在肝癌中的作用提供了体外细胞系模型,基于此稳定株的研究,发现p100能够影响HepG2肝癌细胞的多种细胞功能。     

针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析

目的：针对人Tudor-SN蛋白T103位点（103位苏氨酸,Thr103）制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法：首先人工合成含磷酸化T103（pT103）位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并利用Western blotting和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗pT103抗体进行鉴定;最后以In-cell Western法进行Tudor-SN蛋白的应激磷酸化/去磷酸化时相性分析。结果：（1）确定并合成磷酸化多肽“TIENKpTPQGRC”,收集约75 ml兔源抗血清,纯化后获取2.08 mg/ml抗pT103抗体;（2）当HeLa细胞受到氧化应激时,以pT103抗体检测的磷酸化信号增强,可在胞浆中检测到颗粒状信号,与内源性Tudor-SN应激颗粒存在共定位关系;（3）在氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论：成功制备针对Tudor-SN蛋白T103位点的兔源多克隆抗pT103抗体,有助于从磷酸化修饰角度进行Tudor-SN在细胞应激方面的机制探讨。     

活细胞内MGTR1-3＇UTR的荧光标记及应激定位分析

利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构（含有MS2蛋白结合位点）的RNA之间的高度亲和力,对外源性入血管紧张素l型受体（angiotensin II receptor type1,AGTRl）mRNA3’端非翻译区（3＇untranslated region,3’UTR）片段进行红色荧光标记,进而在活细胞（HeLa）内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3qATR和24×MS2,构建重组质粒pSG5／AGTR1—3‘UTR／24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP／MS2和pEGFP／C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示,AGTR1-3UTR-24×MS2 mNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3＇UTR-24×MS2 mRNA;4段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP—GFP共定位的颗粒。该结果表明,针对AGTR1-3‘UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3’UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3＇UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。