具有广泛抗病毒活性的SAMHD1蛋白的研究进展

SAMHD1蛋白是2011年首次被认定为一种独特的天然抗病毒因子,它主要在树突状细胞、巨噬细胞等髓系细胞中表达。它通过降解细胞内dNTPs的水平,使细胞内的dNTPs的水平低于病毒复制所需的水平,从而抑制髓系细胞中反转录病毒和DNA病毒的复制。HIV-2产生的病毒蛋白X(Vpx)可将泛素连接酶与SAMHD1相结合,使SAMHD1分子最后被蛋白酶体降解。最近还发现SAMHD1蛋白活性受多种因子影响,具有调节肿瘤细胞中LINE-1活性的功能。结合最新研究成果对SAMHD1的结构、功能、抗病毒机制以及影响因子进行综述。     

SAMHD1抗艾滋病病毒作用研究进展

SAMHD1蛋白全称为不育-α-基序结构域(SAM域)和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域(HD域)包涵蛋白1,是由真核生物SAMHD1基因编码的蛋白质。研究表明SAMHD1蛋白对机体固有免疫有调控作用,它能够明显上调抗病毒免疫应答,介导由干扰素引起的炎症反应,参与宿主对入侵病毒的防御体系。早期的研究主要集中在其基因突变引起的Aicardi-Goutières综合征(AGS),最新研究发现SAMHD1作为一种核酸水解酶,具有代谢耗竭髓样细胞和树突状细胞内dNTP池从而抑制I型艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV-1)cDNA合成的功能。而HIV-2和猴免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)辅助基因编码的Vpx蛋白则能拮抗SAMHD1对病毒复制的抑制作用。近年来,有关SAMHD1蛋白的功能及其抗病毒作用机制的研究进展迅速,本文主要对此加以综述。     

SAMHD1蛋白抗病毒作用机制研究的新进展

作为新发现的抗病毒因子,SAMHD1蛋白是近年来分子生物学界研究的热点,但是其抗病毒作用机制尚不明确。已经报道的可能的抗病毒作用机制包括d NTP水解酶活性和T592位点的磷酸化状态。随着近两年来研究的不断发展,SAMHD1蛋白的RNA酶活性和维持基因组稳定性的重要作用相继被发现。与此同时,SAMHD1蛋白的多聚体结构也受到了广泛的关注,从最初得到的二聚体晶体,到最近证实了GTP作为激活剂才能形成有抗病毒活性的同源四聚体,SAMHD1蛋白的多聚体结构及形成机制都得到了新的阐释。综合各种已知的生物学功能以及结构方面的信息,结合最新发表的研究成果,深入而全面地分析了SAMHD1蛋白复杂的抗病毒作用机制。     

病毒蛋白Vpx介导抗病毒因子SAMHD1降解的研究进展

艾滋病是由于HIV感染引起的一种致死率极高的传染病。在HIV-2/SIV中特异性表达的Vpx蛋白可以促进病毒在特定细胞中的复制。这种促进作用是由Vpx介导CRL4E3复合物形成,进而通过蛋白酶体途径降解抗病毒因子SAMHD1实现的。SAMHD1蛋白的多个结构域,包括N末端、入核信号、连接区、HD结构域、以及C末端对于Vpx诱导的降解都具有重要意义。缺少Vpx的HIV-1在进化过程中也逐渐获得了抵御宿主抗病毒因子SAMHD1的能力,如对低dNTPs水平的忍耐力及通过cyclin L2对SAMHD1进行降解。本文依据文献发表的时间进程,结合最新研究成果,对Vpx介导SAMHD1降解并促进病毒感染的作用机制进行综述。     

HIV辅助蛋白拮抗细胞限制因子机制研究进展

抗病毒限制因子成为病毒学研究领域的热点。近些年陆续发现了4种HIV限制因子:APOBEC3G、Trim5α、Tetherin、SAMHD1。其中APOBEC3G、Tetherin、SAMHD1分别被HIV编码的辅助蛋白Vif、Vpu、Vpx所拮抗。这些辅助蛋白影响病毒的致病性和复制能力,拮抗宿主内的天然抗病毒限制因子,使病毒能够成功的侵染宿主细胞。本文重点综述了这三种能拮抗宿主限制因子的HIV辅助蛋白的功能研究进展。     

RANTES衍生物与HIV-1进入抑制剂

HIV-1-1进入抑制剂的研究是近年来艾滋病药物研发领域的新热点,其中最受关注的是以CCR5为靶点的新药研发。CCR5是病毒进入细胞的主要辅助受体,在HIV-1进入宿主细胞过程中起着非常重要的作用。作为CCR5的天然配体,CC类的趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β都是极具潜力的HIV-1抑制剂,特别是有关对RANTES的定向设计的研究尤为引人关注,其目的是设计出一种既有很强的抗病毒能力而又不引发炎症反应的HIV-1拮抗剂。就RANTES衍生物应用于抑制HIV进入细胞方面的研究进行了综述。     

野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1Vif蛋白的相互作用。这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与Vif蛋白有良好的体外结合力。本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外Vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础。     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。     

Sp100与HIV-1整合酶互作并抑制其介导的病毒整合

Sp100是核颗粒ND10的组成蛋白,在哺乳动物细胞中广泛存在．Sp100参与多种细胞生理病理过程,如转录调控、细胞内抗病毒免疫等．利用酵母双杂交系统,我们发现了Sp100的互作蛋白HIV-1整合酶,免疫共沉淀实验进一步证实了Sp100与 HIV-1整合酶的互作,细胞内荧光共定位实验也证实了二者在细胞内部分共定位．此外,突变体实验表明,Sp100的C端300～480氨基酸和HIV-1的催化结构域是两个蛋白质的互作区域．利用siRNA降低细胞内Sp100的表达量,可以增加HIV-1整合酶介导的病毒的整合,反之,细胞内过表达Sp100则会降低HIV-1整合酶介导的病毒的整合．这是首次发现Sp100可以和HIV-1整合酶发生相互作用,并进而抑制病毒的整合．我们发现了Sp100作为HIV-1整合酶互作蛋白的新功能,并扩展了细胞防御病毒感染的相关研究．     

人类免疫缺陷病毒1型与细胞间的相互作用

自从发现人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)是引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体后,人们对HIV-1与人体相互作用的过程进行了深入研究.通过研究发现了HIV-1与机体相互作用的多种机制,例如HIV-1主要侵犯人体以CD4 T细胞为主的表达其结合表位(如CCR5和CXCR4)的免疫活性细胞[1].目前研究者在正常机体内发现多种物质与HIV-1致病有关.例如APOBEC蛋白(人体内主要为APOBEC3G),当HIV-1侵入机体后,该蛋白表达减少,这一过程在HIV-1的致病过程中发挥重要作用.通过对这些蛋白或分子的研究,进一步揭示了HIV-1的致病机制,为治疗HIV感染/AIDS提供了新思路.同时不同的HIV-1感染细胞模型的构建为AIDS的研究提供了多种工具.     

HIV-1中和抗体和基于抗体的疫苗设计

研制一种安全有效并能广泛使用的HIV疫苗对于预防和控制HIV的流行具有重要的意义。尽管人类在HIV-1病原学和免疫学方面的认识不断取得新的进步,对于HIV-1而言,普遍认为诱导保护性中和抗体的科学障碍很难逾越。在抗击HIV-1的感染中传统的疫苗策略不能提供保护。然而,近来的研究揭示在小部分HIV-1感染病人的血清中存在的某些抗体能够中和大多数的HIV-1毒株,对这些血清抗体的深入分析有助于人们揭示抗体识别的病毒表位,这些研究表明自然产生的能够中和HIV-1的中和抗体的发现可能引导未来疫苗设计的思路。高分辨率的结构信息将揭示Env 和中和抗体(Nab)结合区原子水平的结构,这些信息能够帮助设计更好的免疫原。     

核糖体失活蛋白抗HIV-1作用的研究进展

核糖体失活蛋白(RIPs)抗HIV-1活性研究已有十几年的历史。RIPs类化合物代表了抗HIV/AIDS天然产物或先导化合物发展的一个重要方向。本文从介绍RIPs的酶活性及其抗HIV-1活性入手,对RIPs抗HIV-1的可能机制,从与RIPs酶活性的关系、诱导HIV-1感染细胞的凋亡及相应的信号转导、诱发活性氧的产生,以及对HIV-1整合酶的抑制作用等几个方面做了较详尽的阐述,并对RIPs的结构修饰和抗HIV-1构效关系进行了综述。对RIPs类化合物在抗病毒领域进行深入而系统地研究,能拓宽其在抗HIV/AIDS临床上的进一步应用。     

发现平顶猴易感HIV-1重要分子机制

在国家自然科学基金和“973”项目的支持下，中国科学院昆明动物研究所研究员郑永唐组和宿兵组合作，发现在旧大陆猴平顶猴对HIV-1易感的重要分子机制，并首次发现新型天然免疫分子mnTRIMCyp。此项研究进一步阐明了天然免疫分子TRIM5α限制HIV-1感染和复制的作用机制，也为国际HIV／AIDS研究广泛关注的HIV／AIDS非人灵长类动物模型建立提供了重要思路。     

HIV病毒潜伏库的形成机制和对策挑战

长期以来,病毒潜伏库(latent viral reservoir, LVR)的存在严重阻碍了AIDS的有效治疗,LVR无法被人体免疫系统识别,高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy, HAART)对其无效,一旦中断抗病毒治疗,患者会出现快速耐药和病毒血症反弹。截至目前,研究报道的克服该障碍最常用的方案是"激活并杀死"策略,即应用潜伏库逆转剂(latency-reversing agents, LRAs)重新激活潜伏的HIV-1病毒,再利用抗病毒药物和人体免疫系统杀死激活的病毒;另一种方法是通过不可逆地抑制HIV-1的转录使病毒永久沉默,不再具有转录活化的能力。本文综述了HIV-1 LVR的形成和维持机制以及目前文献中报道的LRAs,并介绍了一种使病毒永久沉默的基因疗法,旨在为HIV-1感染提供更安全有效的治疗方法。     

利用假病毒技术研究抗HIV-1药物的作用机制

采用假病毒系统对5种具有抗HIV-1活性的天然化合物的作用机制进行研究, 建立了一种可在普通实验室进行抗HIV-1作用机理研究的实验平台。通过构建假病毒系统, 利用定量PCR实验分析感染细胞内病毒生命周期早期的特异性DNA产物, 发现5种化合物可通过不同的作用机制在早期抑制HIV-1复制。部分化合物表现出新的作用机制, 如LC-1、LC-2可抑制HIV-1的入核。通过分析药物对2种不同的逆转录病毒(HIV-1和MLV)的感染性, 发现LC-1可特异地阻断HIV-1的复制, 而对MLV无影响。同时为了检测药物是否也会在病毒的生命周期晚期有作用,利用直接转染前病毒质粒的方式进行了验证。利用以上方法, 初步确定了这几种药物的作用靶点, 构建了一个有效的抗HIV-1药物作用机理的研究平台。     

干细胞样记忆型T细胞在HIV-1感染中作用的研究

干细胞样记忆型T细胞(Stem memory T cells,Tscm)是最早期分化的、存活时间最长的一类记忆型T细胞。这类细胞具有自我更新及多能分化等干细胞特性,其在抗肿瘤中具有重要的作用,在HIV-1感染中的作用也开始成为研究热点。本文对Tscm细胞的特点、CD4+Tscm细胞在HIV-1病毒储藏库中的重要性及CD8+Tscm细胞抗病毒作用的最新研究进行介绍。了解并充分利用Tscm细胞的特性及其在HIV-1感染中的作用,将有助于开发以Tscm为靶点的HIV-1疫苗及免疫治疗新方法,为HIV-1的防控及功能性治愈提供新的策略。     

血浆microRNA与HIV感染及治疗关系的研究

本次研究分析了Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)感染者血浆中miRNA表达特点,探讨了血浆miRNA作为HIV-1感染及治疗监测生物学标志物的潜在可行性。选取2017年7月-2018年7月期间在昆明市第三人民医院就诊的HIV-1感染未经抗病毒治疗患者50例作为未治疗组,HIV-1感染经抗病毒治疗患者50例作为治疗组,选取同期本院健康体检者50例作为对照组,应用qPCR技术检测三组对象血浆miR-29a、miR-122,miR-155的相对表达量。结果显示,与健康对照组相比HIV-1感染未经抗病毒治疗组血浆miR-29a、miR-155、miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05);未治疗组与治疗组相比较血浆miR-29a、miR-155和miR-122表达均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。对未治疗组的研究显示,血浆miR-29a、miR-155表达水平与HIV-1RNA病毒载量呈正相关(P<0.05),miR-122与HIV-1RNA病毒载量无显著相关(P>0.05),miR-29a、miR-155表达水平与CD4;T细胞计数呈负相关(P<0.05)。本研究提示HIV-1感染后血浆miRNA有变化,血浆miR-29a、miR-122,miR-155与HIV-1感染相关,可能是HIV-1感染的潜在生物学标志物。而抗病毒治疗可以诱导miR-29a、miR-155和miR-122表达降低,这些miRNA可能具有成为监测HIV-1感染抗病毒治疗效果观察指标的潜在价值。未治疗组血浆miR-29a、miR-155与HIV-1RNA呈正相关,表明其与HIV-1病毒复制相关。     

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶在大肠杆菌中的表达及其初步纯化

Ⅰ型人免疫缺陷病毒(HIV-1)逆转录酶(RT)在抗病毒感染及AIDS治疗药物的设计中是一个重要的靶分子,并且可作为工具酶应用于逆转录PCR等分子生物学研究中。本研究将HIV-1RT基因经PCR扩增并修饰后克隆入大肠杆菌表达载体pBV220,所获重组子所表达的HIV-1RT蛋白占菌体总蛋白的8％左右,且经[~3H]dTTP掺入法证实该重组HIV-1RT具有RT聚合酶活性。用Q-Sepharose层析柱对重组HIV-1RT蛋白进行了初步纯化,所获纯化样品的RT聚合酶比活性(1.7×10~4U/mg)比纯化前的裂解上清提高612倍。     

靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究

RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础。vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点。miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势。本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi。本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达。miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miR-NA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当。与携带靶序列的荧光素酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性。用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制。实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好。进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平。miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础。