鲤鱼线粒体tRNA~（phe）基因结构的特异性

在脊椎动物线粒体基因组的研究中,迄今为止已测定了人、牛、大鼠、爪蟾、鲸鱼、海豹、鸡等动物线粒体基因组的全序列。结果表明,脊椎动物线粒体基因组结构排列非常紧密。２２个ｔＲＮＡ基因分布于结构基因和ｒＲＮＡ基因之间,并随其临近的基因一起转录,随后被精确地剪切下来,继续加工成熟。线粒体ｔＲＮＡ与细胞质ｔＲＮＡ相比有许多不同之处,如：Ｄ环碱基数目明显减少;ＴΨＣ环中缺少Ｔ５４－Ｃ－Ｐｕ－Ａ序列;且各个臂上有高比例的碱基错配;同时在线粒体ｔＲＮＡ中Ａ＋Ｕ含量很高。目前有报道指出线粒体中某些ｔＲＮＡ三叶草结构的变化与物种的进化相关联,但这一说法是否具有普遍性尚须探讨。我们最近完成了鲤鱼线粒体ｔＲＮＡｐｈｅ基因的结构分析（图一）,并将其与上述已报导的几种脊椎动物线粒体ｔＲＮＡｐｈｅ基因进行了比较（表一）,发现这些ｔＲＮＡｐｈｅ基因的Ｄ臂上都存在一个１３ｂｐ的强保守区,而其它２１种线粒体ｔＲＮＡ基因上的这一区域却是最不保守的。我们将此保守区前７个碱基与真核生物ＲＮＡＰｏｌⅢ识别的Ａ区相比较,发现ＲＮＡＰｏｌⅢ识别的Ａ区的３个强保守碱基在碱基类型与碱基排列位置上完全与此保守区相同（图二）。考虑到ｔＲＮＡｐｈｅ基因在线粒体基因组     

鲤鱼线粒体tRNA^CYS基因和轻链复制起始区的结构分析

我们测定了鲁鱼线粒体半胱氨酸ｔＲＮＡ基因和轻链复制起始区的核苷酸序列,绘制了半胱氨酸ｔＲＮＡ三叶草形的二级结构以及Ｌ链复制区的茎环结构。通过种脊椎动物ｔＲＮＡ＾ＣＹＳ基因的核苷酸序列分析发现,鲤鱼线粒体ｔＲＮＡ＾ＣＹＳ基因的不寻常的结构特点。鲤鱼线粒体Ｌ链复制起始区含有３６个碱基,复制起始区茎环名的茎含有１１对碱基,而环则是由１４个碱基组成。同其它１０种脊椎动物Ｌ－链复制起始区的核苷酸序列比较发现     

鲤鱼线粒体tRNA~(phe)基因结构的特异性

鲤鱼线粒体tRNA~(phe)基因的核酸序列已被测定。在鲸、人、爪蟾、牛、小鼠、鸡和鲤鱼中对此基因序列比较发现在D茎存在一个奇怪的保守结构,然而D茎在其余种类的已经测定的脊椎动物线粒体tRNA基因和细胞质tRNA基因中是极不保守的。这一保守结构包含有13bp碱基,我们将此保守区前7个碱基与真核生物RNA PolⅢ识别的A区相比较,发现在此不同物种的两种序列存在部分的同源性。考虑到tRNA~(phe)基因在线粒体基因组上位于置换环区和线粒体rRNA基因编码区之间这一特殊区域内,我们推测这一奇怪的保守结构可能存在其它更为有意义的功能。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)线粒体DNA控制区及其两侧tRNA基因的克隆与结构分析

动物线粒体ＤＮＡ控制区是线粒体基因组复制与基因表达的最主要的调控区．采用杂交和测序的方法对草鱼线粒体ＤＮＡ控制区进行定位、克隆并测定了控制区及其旁侧的ｔＲＮＡＰｈｅ、ｒＲＮＡＰｒｏ和ｒＲＮＡＴｈｒ三个基因的序列,与多种脊椎动物的相应序列进行了比较,并进行了结构分析．草鱼线粒体控制区全长９２７ｂｐ,含有与酵母和爪蟾线粒体启动子相似的序列,其ＣＳＢⅠ、ＣＳＢⅡ和ＣＳＢⅢ序列与其他几种动物的ＣＳＢ比较相当保守,ＴＡＳ与其回文基序可形成稳定的茎环结构,成为Ｈ－链复制的终止信号．草鱼线粒体ｔＲＮＡＰｈｅ、ｔＲＮＡＰｒｏ和ｔＲＮＡＴｈｒ可折叠成三叶草形二级结构,其基因具有许多不同于细胞质ｔＲＮＡ基因的结构特点,可能反映了线粒体ｔＲＮＡ与线粒体核糖体具有不寻常的作用方式     

鲤鱼线粒体tRNA~(Cys)基因和轻链复制起始区的结构分析

我们测定了鲤鱼线粒体半胱氮酸tRNA 基因和轻链(L 链)复制起始区的核苷酸序列,绘制了半胱氨酸tRNA 三叶草形的二级结构以及L 链复制区的茎环结构。通过五种脊椎动物tRNA~(cya)基因的核苷酸序列分析发现,鲤鱼线粒体tRNA~(cya)基因有许多不同于细胞质tRNA~(cya)基因的不寻常的结构特点。鲤鱼线粒体L 链复制起始区含有36个碱基,复制起始区茎环结构中的茎含有11对碱基,而环则是由14个碱基组成。同其它10种脊椎动物L-链复制起始区的核苷酸序列比较发现,鲤鱼茎环结构中的茎序列是非常保守的,而环的序列及环的长度则变化较大。茎环结构可能在轻链复制中起着重要的作用。     

马来熊的DNA序列分析与遗传多样性研究

马来熊在ＩＵＩＣＮ红皮中被列为受胁动物,其保护受到广泛的关注,本文研究了４只马来熊的线粒体ＤＮＡ序列,其中１只来自云南,其余３只产地不详,但来自不同的搜集渠道,对于每个个体,我们测定了３９７ｂｐ的细胞色素ｂ基因,３４６ｂｐ的１２ＳｒＲＮＡ基因,９８ｂｐ的ｔＲＮＡ基因和３３３ｂｐ的Ｄ环区序列,共计１１７４ｂｐ。经与黑犀牛序列比较,发现ＲＮＡ基因的空间结构对基因的进化有显著影响,环区的进化明显快于茎区     

鲤鱼线粒体tRNA^phe基因结构的特异性

在脊椎动物线粒基因组的研究中。迄今为止已测定了人、牛、大鼠、爪蟾、鲸鱼、海豹、鸡等动物线粒体基因组的全序列。结果表明,脊椎动物线粒体基因组结构排列非常紧密。22个tRNA基因分布于结构基因和rRNA基因之间,并随其临近的基因一起转录,随后被精确地剪切焉,继续加工成熟。线粒体tRNA与细胞质tRNA相比有许多不同之处,如D环碱基数明显减少：TψC环中缺少T54－C－Pu－A序列：且各个臂上有高比例的碱基错配;同时在线粒体rRNA中A＋U含量很高。目前有报道指出线粒体中某些tRNA三叶草结构的变化与物种的进化相关联,但这一说法是否具有普遍性尚须探讨。我们最近完成了鲤鱼线粒体tRNA^phe基因的结构分析（图一）,并将其与上述已报导的几种脊椎动物粒体tRNA^phe基因进行了比较（表一）,发现这些tRNA^phe基因的D臂上都存在一个13bp的强保守区,而其它21种线粒体tRNA基因上的这一区域都是最不保守的。我们将此保守区前7个碱基与真核生物RNAPollIII识别的A区相比较,发现RNAPolIII识别的A区的3个强保守碱基在大事箕类型与碱基排列位置上完全与此保守区相同（图二）。考虑到tRNA^phe基因在线粒体基因组上位于置换环区和线粒体rRNA基因编码区之间这一特殊区域内,这种结构上的特殊性暗示着tRNA^phe基因与其它tRNSA基因在功能上存在着差异。鲤鱼线粒体tRNA^phe基因位于D环与12sRNA基因之间,由重链编码,长度为67bp,同哺乳动物线粒体tRNA基因一样,也不编码3′端的CCA序列。鲤鱼线料体tRNA^phe基因G＋C／A＋U＝0．76,可见其A＋U含量明显高于细胞质tRNA,从其二级结构上看,其氨基酸臂富含GC 对,存在二个错配碱基对,TψC环无TψC序列,T茎也有高比例的错配,且无细胞质tRNSA中特有的那组G－C对,D环由6个碱基组成,其D臂完全互补配对。在已知种类的线粒体其他tRNA基因结构中,反密码环最为保守,其次为氨基酸臂,D环和T环及其相应的臂最不保守。但是在tRNA^phe基因中最保守的却是D环的臂。这种tRNA^phe基因结构上的不寻常性,显示了其功能上的不寻常性,目前人们普遍的看法是线粒体tRNA^phe基因在其转录过程中,还起着识别转录本加工信号的作用,但这一过程的细节目前还不甚清楚。从结构上看,tRNA^phe基因 位于线粒体基因组D环一侧,而D环上具有重链复制启动始点和重链轻链转录调控区。在绝大多数由重链编码的基因中,tRNA^phe基因是被首先转录的基因,同时也是在各种成熟RNA转录本中,必须被剪切下来的tRNA。由此可见tRNA^phe基因在转录水平以及转录后的加工水平上均具有特殊的调控作用。我们推测脊椎动物tRNSA^phe其D臂上强保守结构的存在,也正是这种作用的一种反映。关于tRNA^phe基因结构与功能的关系及其表达调控特性的研究正在进行中。     

大肠杆菌亮氨酰－tRNA合成酶基因的克隆和鉴定

本文根据遗传互补原理,利用大肠杆菌亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶基因（ｌｅｎＳ）的温度敏感突变株ＫＬ２３１,从大肠杆菌基因文库一克隆（λ１５Ｄ７）中筛选出带完整ｌｅｕＳ基因的ＤＮＡ片段。该片段长度为３．２ｋｂ。对此片段做了１４种限制性内切酶图谱分析和部分ＤＮＡ序列鉴定,并与文献报道的ｌｅｎＳ基因序列进行了比较。发现在编码区和３’端非编码区各有一对碱基发生了转换。另外在３’端非编码区有一对碱基缺失。编码区的碱基对转换导致编码的氨基酸由组氨酸变成了精氨酸。带有ｌｅｎＳ基因的质粒（ｐＬｅｕＳ９１）转入大肠杆菌ＴＧＩ菌株中,测得转化子的亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶比活力是ＴＧ１菌株的１０倍以上。     

大肠杆菌苯丙氨酸合成途径关键酶基因pheA的克隆与表达

为了通过基因工程手段来增加苯丙氨酸的生物产量,利用ＰＣＲ方法从大肠杆菌中克隆了抗反馈抑制突变型及野生型的ｐｈｅＡ基因,进行了核苷酸序列分析,并利用高效的原核表达载体ＰＢＶ２２０对ｐｈｅＡ基因编码的突变型及野生型分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（ＣＭ／ＰＤ）进行了表达。序列分析表明突变型基因碱基第５８０位由Ｔ变为Ｃ,相应氨基酸由Ｖａｌ变为Ａｌａ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱扫描分析表明目的蛋白ＣＭ／ＰＤ的表达量占全菌体蛋白的４３％,占上清总蛋白的５７％。酶活性测定表明其ＣＭ和 ＰＤ活性分别提高了 １５．５和６．７倍,产酸量也有了一定的提高,为构建产苯丙氨酸的生物工程菌奠定了基础。     

线粒体tRNA^Trp的原核起源

构建了３种来源于水稻、人和啤酒酵母的线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ基因。实验表明这些线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的体外转录产物具有被枯草杆菌色氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＴｒｐＲＳ）氨酰化的能力,但是不能被鼠肝来源的氨酰ｔＲＮＡ合成酶粗酶所催化。动力学资源常数测定表明枯草杆菌ＴｒｐＲＳ对线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的亲和力为野生型ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的一半,而在催化效率上,水稻和啤酒酵母线粒体ｔＲＮＡ＾Ｔｒｐ的色氨酰化能力比野     

双翅目昆虫线粒体基因组结构特点及其测序通用引物的设计和应用

研究双翅目昆虫线粒体基因组的结构特点, 并设计其测序的通用引物, 为今后双翅目昆虫线粒体基因组的研究提供参考和依据。利用比较基因组学和生物信息学方法, 分析了已经完全测序的26个双翅目昆虫线粒体基因组的结构特点、 碱基组成和保守区, 并据此设计了双翅目昆虫基因组测序的通用引物。结果表明： 双翅目昆虫线粒体基因组长14 503~19 517 bp, 其结构保守, 含有37个编码基因, 包括13个蛋白质编码基因, 22个tRNA编码基因和2个rRNA编码基因, 此外还包含一段长度差异很大的非编码区(AT富含区)。基因组内基因排列次序稳定, 除个别基因外, 其余都与黑腹果蝇Drosophila melanogaster基因排列次序一致。基因组的碱基组成不均衡, AT含量在72.59%~85.15%之间, 碱基使用存在偏向性, 偏好使用AC碱基。全基因组的核苷酸和氨基酸序列保守, 共鉴定了11个保守区。在保守区内共设计了26对双翅目线粒体基因组测序通用引物, 扩增的目标片段都在1 200 bp以内。将该套通用引物用于葱蝇Delia antiqua线粒体全基因组测序, 结果证明其高效、 合用。     

RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构与功能

ＲＮＡ聚合酶Ⅲ (ｐｏｌⅢ )是真核生物催化合成ｔＲＮＡ和 5ＳｒＲＮＡ及一些核小ＲＮＡ和胞质ＲＮＡ必需的酶。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ能够识别ｔＲＮＡ基因中一些高度保守的特征性ＤＮＡ序列而启动下游ＤＮＡ的转录 ,这些序列称为ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子不仅广泛存在于真核细胞中ｔＲＮＡ、Ｕ6核小ＲＮＡ(ＳＮＲ6 )等的基因中 ,也是病毒催化合成一些小片段ＲＮＡ如腺病毒ＶＡＲＮＡ所必需的。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子因其能在体内外高效快速地转录某些小片段基因 ,已被人们广泛地应用于核酶和反义ＲＮＡ技术中 ,在众多的ＲＮＡ…     

与圈卷产色链霉菌分化有关的一个新基因—sawD的研究

距链霉菌发育分化控制启动子 Ｐ Ｔ Ｈ４ 直接控制的下游基因 ｐｒｏ Ｘ 间隔２４ 个碱基处存在一个部分开放阅读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 根据序列分析推测为丝氨酸蛋白酶的一部分。以此部分 Ｄ Ｎ Ａ 序列为探针, 在构建的圈卷产色链霉菌７１００ 的 Ｄ Ｎ Ａ 文库中克隆到一个与链霉菌发育和分化有关的新基因, 称之为ｓａ ｗ Ｄ。序列测定及分析结果表明, 在１３２０ｂｐ 的 Ｄ Ｎ Ａ 序列中有一个完整的开放阅读框 （ Ｏ Ｒ Ｆ） , 翻译起始位点为２１０ 位碱基处的 Ｇ Ｔ Ｇ, 终止密码子 Ｔ Ｇ Ａ 位于序列的９９９ 位碱基处。在距翻译起始位点 Ｇ Ｔ Ｇ 上游４ 个碱基间隔处有典型的核糖体结合位点区域 Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ。在计算机蛋白文库中进行了同源性比较研究, 结果表明２６３个氨基酸的蛋白产物与 Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ 的依赖于 Ａ Ｔ Ｐ 的丝氨酸蛋白酶有４４７ ％ 的同源性, 其中存在功能活性区的丝氨酸保守位点 （ Ｇ Ｐ Ｓ Ａ Ｇ） 。基因功能研究表明, ｓａｗ Ｄ 在圈卷产色链霉菌发育分化中与气生菌丝分隔和色素的合成有关。该基因被阻断或破坏后, 使野生型圈卷产色链霉菌的分化停止在气生菌丝阶段, 不能形成具有灰色色素的孢子, 而出现白色     

鸮形目4种鸟类线粒体调控区全序列的测定与比较研究

利用Long-PCR和Primer Walking的方法对鸮形目的短耳鸮、长耳鸮、纵纹腹小鸮、灰林鸮4种鸟类的线粒体调控区进行了全序列测定。结果表明：短耳鸮的调控区跃度为3290bp;长耳鸮为2848bp;纵纹腹小鸮为2444bp;灰林鸮为1771bp。短耳鸮的调控区长度是4种鸮中最大的,并且是目前已知最大的鸟类线粒体调控区。这4种鸮类调控区的基本结构和其他鸟类相似,按照碱基变化速率的不同可以分为3个区：碱基变化速率较快的外围区域Ⅰ、Ⅲ和保守的中间区域Ⅱ。这4种鸟类调控区的3’端均存在大量的串联重复序列,短耳鸮为126bp单元重复7次和78bp单元重复14次;长耳鸮为127bp单元重复8次和78bp单几重复6次;纵纹腹小鸮有3个重复单元,分别为89bp单元重复3次、77bp单元重复4次和71bp单元重复6次;灰林鸮仅有1个单元的串联重复为78bp重复5次。调控区中串联重复序列可能是由链的滑动错配产生,另外这些重复序列都能形成热力学稳定的多重茎环二级结构,而且在重复序列中还发现一些保守基序,这说明重复序列可能具有一定的生理功能,影响调控区的调重控功能从而影响线粒体基因组的复制和转录。     

基于第二代测序技术兰州鲇线粒体基因组全序列测定与分析

研究采用高通量第二代测序技术,构建获得兰州鲇（Silurus lanzhouensis）线粒体基因组全序列,并对全序列特征和结构进行了分析。研究结果表明,兰州鲇线粒体基因组全序列长度为16523 bp,碱基组成具有高A+T低G+C含量的偏向性,具有脊椎动物典型的结构组成。13个PCG基因中存在2种启动子（ATG、GTG）、3种终止子（TAG、TAA和T或TA）。除tRNA-Ser（AGN）基因二级结构中DHU臂缺失,其余21个tRNA基因可折叠成典型三叶草结构。12S rRNA二级结构由45个茎环结构组成4个结构域,16S rRNA由54个茎环结构组成6个结构域。含有关键序列标签的控制区（CR）可分为3个不同的结构域:终止序列区（TAS1、TAS2）、中央保守区（CSB-F、CSB-E和CSB-D）和保守序列区（CSB1、CSB2和CSB3）。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列区（O_L）。基于线粒体基因组全序列和通用标签COX1基因标记可区分兰州鲇同其他鲇形目鱼类种质进化关系。     

短散在元件（NINE）的研究进展

短散在元件（ＳＩＮＥ）广布于真核生物,是基因组中的可转移成分,长约１００～５００ｂｐ,拷贝数可达数百至数十万以上,根据序列变异和鉴别位点常可分为若干家族和亚家族,对基因组的复杂化、基因的钝化、新基因的产生、尤其是基因表达的调控都具有重要意义。除了灵长类Ａｌｕ和小鼠Ｂ１家族等少数来源的于７ＳＬ ＲＮＡ,大多为ｔＲＮＡ的衍生物,由ｔＲＮＡ同源区、ｔＲＮＡ无关区和富含ＡＴ区等组成。在ｔＲＮＡ同源区含有Ｒ     

Gene Cloning, Overproduction and Purification of Escherichia coli tRNA_2~(Arg)

合成的编码大肠杆菌ｔＲＮＡＡｒｇ２的基因,嵌入受ＩＰＴＧ诱导启动子控制的质粒ｐＴｒｃ９９Ｂ中。用上述含目的基因的质粒转化大肠杆菌ＭＴ１０２,得到ｔＲＮＡＡｒｇ２基因序列正确的克隆。诱导表达后,与受体菌相比,转化子中的ｔＲＮＡＡｒｇ的含量高出１０倍,ｔＲＮＡＡｒｇ２的含量高出３０倍,占总ｔＲＮＡ的７０％。ＤＥＡＥＳｅｐｈａｃｅｌ柱层析后,ｔＲＮＡＡｒｇ２的纯度即可达到８８％。再用ｂｅｎｚｙｌＤＥＡＥｃｅｌｕｌｏｓｅ柱层析可得到纯度为９９％、精氨酸接受活力为１６００ｐｍｏｌｅ／Ａ２６０单位的ｔＲＮＡＡｒｇ２。从４升过夜培养液中得到的４０ｍｇ总ｔＲＮＡ。从中可得到１８ｍｇ纯ｔＲＮＡＡｒｇ２,产率为６２％。首次精确地测定了精氨酰ｔＲＮＡ合成酶催化ｔＲＮＡＡｒｇ２时的动力学常数。     

大肠杆菌亮氨酰tRNA合成酶基因的克隆和鉴定

本文根据遗传互补原理,利用肠杆菌亮氨－ｔＲＮＡ合成酶基因的温度敏感突变株ＫＬ２３１,从大肠杆菌基因文库－克隆中筛选出带完整ＬｅｕＳ基因的ＤＮＡ片段。该片段长长度为３．２ｋｂ。对此片段做了１４种限制性内切酶图谱分析和部分ＤＮＡ序列鉴定,并与文献报道的ＬｅｕＳ基因序列进行了比较。发现在编码区和３＇端非编码区各有一对碱基发生了转换,另外在３＇端非编码区有一对碱基缺失。编码区的碱基对转换导致编码的氨基酸由     

大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达

ａｒｏＧ基因编码的 ３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ　Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ＤＳ）和 ｐｈｅＡ基因编码的分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（Ｃｈｏｒｉｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ,ＣＷ／ＰＤ）都是本丙氨酸合成途径中的关键酶,为了通过基因工程手段来增加本丙氨酸生物的产量,在利用高效的原核表达载体ｐＢＶ２２ ０对ｐｈｅＡ基因编码的ＣＭ／ ＰＤ 酶进行了表达的基础上,采用ＰＣＲ方法扩增了抗反馈抑制的ａｒｃＧ基因,进行克隆表达,并与ｐｈｅＡ基因串联,以ＰＲＰＬ－ａｒｏＧ－ＰＬ－ｐｈｅＡ的形式,实现了２种酶基因在大肠杆菌中的表达, ＳＤＳＰＡＧＥ 图谱显示了新增的４３ｋｕ及３５ｋｕ蛋白带,经酶活性测定ＤＳ、ＣＭ／ＰＤ酶的比活分别提高了 ４．６７倍、８０５／１０．７１倍。     

蓝藻OscilatoriaceaerDNA16S-23S基因间隔区的序列分析及其分类学意义

采用末端终止法对蓝藻类颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ１６Ｓ－２３Ｓ基因间隔区进行了序列测定,获得了Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｓｐ．ｒＤＮＡ基因间隔区４２７个核苷酸,其中包含１个异亮氨酸ｔＲＮＡ基因（ｔＲＮＡＩｌｅ）。并通过计算机联网从国际分子生物学数据弹库中获取颤藻科其它种的ｒＤＮＡ基因间隔区序列,通过比较分析,从分子水平对颤藻科Ｏｓｃｉｌａｔｏｒｉａｃｅａｅ属间的某些分类学问题进行了讨论,并根据序列中核苷酸差异值探讨了颤藻科属间界定的分子标准。提出了ｒＤＮＡ基因间隔区是良好的分子标记,可用于“赤潮”或“水华”蓝藻专一性核酸分子探针的研制