有机溶剂对黑根霉甾体11α-羟基化的影响

考察了有机溶剂对黑根霉甾体11α-羟基化反应中转化底物16α,17α-环氧孕甾酮生成11 α, 16α,17α-环氧孕甾酮的转化率和细胞色素P450酶浓度的影响.向培养28 h的培养液中添加终浓度0.035 mol/L的丙酮和1.75 g/L的底物,继续转化48 h.与未添加丙酮相比,添加丙酮后的底物转化率和细胞色素P450酶表达量分别提高了6.8%和30%.说明丙酮添加可明显提高黑根霉甾体11α-羟基化能力和细胞色素P450酶的表达.     

微生物转化雄甾-4-烯-3，17-双酮的菌种筛选和转化条件的初步研究

雄甾-4-烯-3,17-双酮(简称4AD)是甾体药物的重要中间产物,其11α羟化产物可制成治疗心血管疾病的药物。通过对30株不同种属真菌转化4AD能力的筛选,获得球孢白僵菌(Beauveria bassiana)QY2A对4AD有高效C11α羟化能力,得到目标产物C11α-羟基雄甾-3,17-双酮(简称11α-OH-4AD)。另对该菌株的转化条件进行优化,结果表明:初始pH值6.0,温度28℃,转速180r/min,转化时间60h,助溶剂甲醇终浓度和底物浓度分别为2.5%和2.5g/L时,11α-OH-4AD的转化率为65%,比未优化的转化率提高了51.2%。     

Gibberella intermedia CA3-1羟基化去氢表雄酮的工艺

利用Gibberella intermedia CA3-1对甾体化合物去氢表雄酮(DHEA)进行C7α-羟基化反应研究。用单因素实验的方法考察接种量、装液量、转速、有机溶剂助溶、投料浓度以及底物投加时间对产物7α-羟基去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)生成的影响。最终确定最适工艺条件:接种量6%,装液量30 m L(250 m L三角瓶),转速220 r/min,体积分数6%丙二醇助溶,接种时即添加底物,底物DHEA质量浓度1 g/L,转化时间36 h。采用优化后的转化条件,7α-OH-DHEA摩尔得率为72.34%。     

离子液体-水双相体系中Gibberella intermedia C1双羟化去氢表雄酮(DHEA)

【目的】考察离子液体-水双相体系中赤霉菌(Gibberella intermedia C1)双羟化甾体类底物去氢表雄酮(DHEA)生成三羟基雄甾烯酮(7α,15α-di OH-DHEA)的生物转化过程。【方法】比较5种不同种类的离子液体([Hmim][PF_6]、[Bmim][PF_6]、[Bmim][BF_4]、[Bmim][NTF2]、[Emim][EtSO_4])对底物转化率和产物得率的影响。优化该双相体系中离子液体的浓度、底物的投料浓度及投料时间等。【结果】选择[Emim][EtSO_4]作为构建该体系的离子液体。摇瓶中最适双相体系转化条件为:菌体生长12 h后,向转化培养基中加入0.8%(体积比)的[Emim][Et SO4],同时投加6 g/L底物DHEA。在5 L发酵罐上,当转化至60 h时,产物浓度高达5.03±0.21 g/L,7α,15α-diOH-DHEA产物摩尔得率达到最高75.5%。【结论】确定了离子液体-水双相转化体系的最适转化条件,并在5 L发酵罐中进行了实验,为该体系的工业化应用奠定了基础。     

利用赭曲霉NG1203羟基化齐墩果酸的研究

考察了利用赭曲霉Aspergillus ochraceusNG1203进行C11α-羟基化齐墩果酸生化反应的条件。得出了菌株摇瓶培养最佳培养基配方(g.L-1):葡萄糖20,玉米浆25,酵母膏3,K2HPO41.5,pH 6.0。菌株培养20 h,加入2 mg.L-1的齐墩果酸利于诱导羟基化酶的产生。菌株在28℃下以150 r.min-1振荡培养24 h,加入底物的乙醇溶液,使转化液中齐墩果酸的初始质量浓度达100 mg.L-1,转化液中乙醇体积分数最终达3%。经96 h转化,齐墩果酸转化率可达到10.12%。通过HPLC1、H NMR和13C NMR分析,结果表明产物为C11α-羟基齐墩果酸。     

Gibberella intermedia C2转化4-雄甾烯-3、17-二酮的研究

甾体化合物具有独特的生理活性,已被广泛应用于抗炎、利尿、免疫、避孕及抗癌等领域。近些年,生物催化与转化在甾体药物中间体合成中发挥的作用日益强大。为了能够合成一些具有潜在价值的新型甾体化合物,以实验室菌种库中保藏的一株Gibberella intermedia C2为研究对象,选取了雄甾烷中一种有广泛用途的化合物4-雄甾烯-3、17-二酮(简称雄烯二酮,AD)为底物进行生物转化。转化液经提取分离,最终获得2个转化产物,经结构鉴定分别为15α-OH-AD和11α,15α-diOH-AD。转化机制研究发现,G.intermedia C2先将底物的15位羟基化生成15α-OHAD,再将其11位羟基化形成双羟基产物。赤霉菌能够特异性、有序地完成对AD的两步羟化反应。此外,通过工艺优化,确定了羟化4AD反应的最适工艺参数如下:发酵培养基的初始pH 6.5,装液量30ml/250ml,底物浓度6.0g/L,转化温度28℃,摇床转速220r/min,转化周期为84h。此时,底物AD的摩尔转化率达到81.5%。     

α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

生物转化法合成16α-羟基泼尼松龙的发酵工艺研究

目的:研究1株玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)的发酵培养基和底物转化条件,以提高16α-羟基泼尼松龙的转化率。方法:采用紫外与氯化锂复合诱变获得目的菌株TS-58,利用正交实验等方法考查摇瓶发酵条件,研究不同浓度的碳源、氮源对玫瑰产色链霉菌生长的影响,以及不同底物浓度、底物加入时间、装液量、金属离子和添加助溶剂等条件对转化生成16α-羟基泼尼松龙能力的影响。结果:获得最佳转化培养基为葡萄糖10 g/L、可溶性淀粉50 g/L、蛋白胨10 g/L、黄豆饼粉25 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、硫酸镁0.5 g/L硫酸锌0.5 g/L。在底物投料量5 mg/mL添加0.8 mg/ml PEG助溶剂的最优条件下,16α-羟基泼尼松龙的转化率达到了13.8%。结论:突变株Streptomyces roseochromogenes TS-58能有效地在泼尼松龙上引入16α-羟基羟基,为工业生产16α-羟基泼尼松龙奠定了基础。     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮

选育到一株对16β-甲基,17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21-乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力.在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,11α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认.     

犁头霉11α-羟基化制备16β-甲基-11α，17α，21 三羟基孕甾-1，4 二烯 3，20 二酮

选育到一株对16β-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅱa)11α-羟基化活性强的犁头霉A28菌株,并发现底物21乙酰化(Ⅱb)可明显提高11α-羟基化的能力。在适宜的转化条件下,Ⅱb投料浓度0.5%,产物16β-甲基-11α,17α,21-三羟基孕甾-1,4-二烯3,20-二酮(Ⅲ)收率为73%,结构经波谱分析确认。     

内皮素-1与PGF2α单独或联合作用对心肌细胞的影响

目的:观测ET-1与PGF2α单独或联合作用对新生大鼠心肌细胞面积与凋亡率的影响,以探讨心肌细胞肥大与凋亡的关系.方法:分离培养新生大鼠心肌细胞,采用鬼笔环肽(phalloidin)荧光染色(定性)与细胞面积测量(定量)两种方法检测心肌细胞肥大;以Hoechst 33258荧光染色检测心肌细胞凋亡.结果:Phlloidin荧光染色显示ET-1或PGF2α单独处理组,心肌细胞肌原纤维纹理清晰,纤维增多且沿细胞长轴方向排列.而ET-1与PGF2α联合处理48 h组的肌原纤维出现纹理模糊与断裂现象.ET-1与PGF2α诱导心肌细胞肥大呈现一定的量-效关系:10nmol/L ET-1处理24 h组心肌细胞面积较对照组增加68%,100 nmol/L ET-1组增加84%.10 nmol/L PGF2α组增加28%,100 nmol/L PGF2α组增加106%.ET-1与PGF2α可协同引起心肌细胞肥大,但缺乏叠加效应:10nmol/LET-1与10 nmol/L PGF2α联合作用组增加80%;10 nmol/L ET-1与100 nmol/L PGF2α组增加122%;而100 nmol/LET-1与10 nmol/L PGF2α组增加96%;100 nmol/LET-1与100 nmol/L PGF2α组增加199%.ET-1与PGF2α单独作用缺乏明显的促心肌细胞凋亡作用.ET-1与PGF2α联合作用24 h对心肌细胞凋亡率亦无明显影响,作用48 h则使心肌细胞凋亡率呈显著性增加.ET-1或PGF2α先引起心肌细胞肥大后,促肥大因子亦可诱导心肌细胞凋亡,且心肌细胞凋亡率与其肥大程度呈正相关.结论:ET-1与PGF2α单独作用仅可促心肌细胞肥大,联合作用48 h则可促心肌细胞凋亡.     

分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C_(1,2)位脱氢反应的研究

9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮(Ⅳ)是生产9-氟甾体激素的关键前体,以9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Ⅰ)为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法,发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化为9β,11β-环氧-17α,21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3,20-二酮(Ⅱ),而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ,其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ,Ⅱ在C_(1,2)位脱氢酶(KSTD)的催化作用下发生C_(1,2)位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的转化率,利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因:kst D、kst D3和kstD_M,提高脱氢反应效率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.0的重组菌株MS136-kst D_M细胞裂解液中反应45h,Ⅳ的转化率为78.4%,比出发菌株提高了38.9%;并优化缓冲液pH,提高反应速率,结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.5的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h,Ⅳ的转化率为92.8%,比出发菌株提高了63.4%。     

沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷

目的初步探索沼泽红假单胞菌粗酶液生物转化柚皮苷的特点。方法利用高效液相色谱技术,以柚皮苷的降解率为指标,考察不同温度、pH、底物浓度和培养时间对粗酶液降解柚皮苷的影响。在适宜转化条件下,探索底物和产物的含量变化。结果最适转化条件:40℃~50℃,pH 7.0~8.0,最大有效转化底物浓度750μg/mL,15 h时柚皮苷降解率较高为55.31%。在最适转化条件下,底物浓度500μg/mL,培养至17 h柚皮苷被降解完全,柚皮素浓度达到最大值204μg/mL,转化率为85.39%;10~19 h,转化率均大于80.00%,13 h达到最大值94.83%。结论本研究首次发现沼泽红假单胞菌粗酶液能够生物转化柚皮苷,并阐明了不同培养条件对柚皮苷降解的影响,以及转化过程中物质含量的变化。     

牛瘤胃分离菌株静息细胞培养体系生物转化黄豆苷原

从牛瘤胃胃液中分离了一株在厌氧条件下能利用其生长细胞将大豆异黄酮黄豆苷原高效还原为二氢黄豆苷原的革兰氏阳性细菌菌株Niu-O16。研究了菌株Niu-O16静息细胞体系转化黄豆苷原的最佳转化条件,通过单因素试验确定菌株Niu-O16静息细胞转化黄豆苷原的最佳条件是:初始pH6.0～8.0,静息细胞浓度32～64mg/mL(湿重),加入底物浓度0.8～1.2mmol/L。通过正交试验确定了静息细胞浓度、加入底物浓度及转化时间的最佳组合为:静息细胞浓度32mg/mL、加入底物浓度0.8mmol/L、转化时间24h;最佳转化条件下底物转化率最高为63.9%。该结果为厌氧菌的静息细胞转化及工业应用提供了参考。     

循环利用重组大肠杆菌细胞转化合成丁二酸

研究了回收丁二酸发酵液中的大肠杆菌进行细胞转化的可行性,以转化率和生产效率为指标,考察了不同菌体浓度、底物浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。发酵结果表明大肠杆菌可以在仅含有葡萄糖和pH调节剂的水环境中转化生产丁二酸,并确定了最佳的转化条件为:细胞浓度(OD600)50,底物浓度40g/L,缓冲盐为MgCO3。基于优化好的条件,在7L发酵罐中进行重复批次转化,第1次转化的转化率和生产效率分别达到91%和3.22g/(L·h),第2次转化的生产效率和转化率达到了86%和2.04g/(L·h),第3次转化的转化率和生产效率分别达到了83%和1.82g/(L·h)。     

三羟基雄甾烯酮高转化菌株的选育及工艺优化

以能将去氢表雄酮 (DHEA) 转化为三羟基雄甾烯酮 (7α,15α-diOH-DHEA) 的赤霉菌Gibberella intermedia CA3-1为出发菌株,对其进行了诱变选育及工艺优化,以期提高转化效率。采用0.12 mg/mL亚硝基胍诱变处理赤霉菌孢子悬液30 min,以350 μmol/L酮康唑为最低抑制浓度进行抗性平板筛选,最终获得一株遗传稳定性较好的高产菌株M-10,其产物摩尔得率达到70.2%,为出发菌株的1.2倍。通过摇瓶转化工艺的优化,确定了突变菌株的最适转化工艺。在优化的转化工艺下,当底物DHEA投料浓度为5 g/L时,7α,15α-diOH-DHEA摩尔得率提高到75.6%,较原始菌株提高了31.3%。     

微乳体系中11β-羟基甲羟孕酮的C1,2生物脱氢

为改善过程传质,提高甾类药物中间体11β-羟基甲羟孕酮C1,2生物脱氢转化率,采用简单节杆菌Arthrobacter simplex UR016菌株在Tween-80/乙醇/食油/水构成的微乳体系中进行生物脱氢,并考察了微乳体系组成、转化温度、投料浓度对脱氢反应的影响。结果表明:以菌体培养液作为水相,食油作为油相构建微乳体系,食油最适加量为10g/L,表面活性剂Tween-80加量为4g/L;底物经醇溶后水析投料,乙醇最适加量为发酵液体积的7%(V/V);最适转化温度为33oC;当底物浓度为4g/L时,在构建的微乳体系中转化46h,脱氢转化率达88.6%,与水相转化工艺相比提高了66.2%。在该体系中疏水性11β-羟基甲羟孕酮底物得到了有效的增溶和扩散,生物脱氢转化率明显提高。     

氧化葡萄糖酸杆菌生物催化1,3-丙二醇合成3-羟基丙酸

3-羟基丙酸是一种潜在的重要化工产品,可作为中间体合成多种有经济价值的工业用化合物。文中利用氧化葡萄糖酸杆菌生物催化1,3-丙二醇合成3-羟基丙酸。首先在50 mL摇瓶中(转化体系为10 mL)考察细胞加入量、底物和产物浓度等对催化反应的影响。在此基础上,在2 L鼓泡塔中(转化体系为1 L),采取适当的补料方式和生物转化与分离相耦合的手段解除抑制,以提高目标产物终浓度。结果表明:高底物和产物浓度通过降低反应初速度抑制转化的进行,并确定了最佳催化反应条件为6 g/L菌体量,pH 5.5。利用流加补料方式维持反应体系中底物浓度在15~20 g/L,经过60 h的反应,3-羟基丙酸的浓度达到60.8 g/L,生产强度为1.0g/(L.h),转化率为84.3%。采用生物转化与分离相耦合的方法,经过50 h的转化反应,3-羟基丙酸的总产量达76.3 g/L,生产强度为1.5 g/(L.h),转化率83.7%。研究结果对利用氧化葡萄糖酸杆菌的不完全氧化醇类化合物特性实现其在工业生物催化中的应用具有一定的指导意义。     

静息细胞转化生产3-羟基丙酸的条件优化

本文研究了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系。考察了以甘油为底物,利用静息细胞转化生产3一羟基丙酸的相关因素,确定了最佳的转化条件：细胞浓度20g／L,甘油浓度20g／L,辅酶VB12浓度10mg／L,NAD＋浓度0．15mmol／L,温度35℃,反应体系为0．05mol／LpH7．0Tris—HCl缓冲液。在上述条件下反应6h后,3-羟基丙酸的产量达到为3．17g／L,底物转化率为28．33％。由上述结果可知,采用静息细胞转化法为3-HP的生物合成提供了一种可能的方法。