苜蓿链霉菌内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的克隆、表达及酶学性质

内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶广泛应用于糖生物学研究和工业生产。本研究从苜蓿链霉菌Streptomyces alfalfae ACCC 40021中克隆并原核表达了一个新的内切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,该酶最适反应温度为35℃,最适pH为6.0,具有良好的pH稳定性、温度稳定性和高比活(1×10~6 U/mg)的特性,可催化不同蛋白底物去糖基化,具有作为工具酶和生物催化剂的潜力。     

一株高产木聚糖酶的枝链霉菌的分离鉴定及产酶

对1株高产木聚糖酶的链霉菌进行了鉴定并研究其木聚糖酶的生产过程及水解产物特点。分离得到1株产木聚糖酶的链霉菌Streptomyces sp.L2001,从形态学特征、培养特征和生理生化特征等方面对该菌株进行了鉴定。PCR扩增得到16S rDNA序列全长为1429bp,分析结果表明,菌株与Streptomyces rameus NBRC3782同源性达99.16%。结合传统生理生化实验结果鉴定为枝链霉菌。菌株液体发酵6d能产生842.0U/mL木聚糖酶活力。经HPLC分析酶解产物,结果显示木二糖、木三糖及木四糖含量之和高达93.5%,该酶适用于工业化生产低聚木糖。     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

[目的] 从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO 40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。[方法] 通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。[结果] 菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycins A₁和D。克隆了链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。[结论] 从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces coelicolor M1154和Streptomyces albus J1074中进行了表达,获得了bafilomycins,为后续bafilomycins结构类似物的生产和链霉菌SCSIO 40020中新结构活性化合物的挖掘奠定了基础。     

一株产天然蓝色素海洋链霉菌的筛选鉴定

从胶州湾附近海域水样中分离筛选到一株可产生天然蓝色素的链霉菌。采用通用引物16F27/16R1492扩增该菌株的16SrDNA,对测序结果进行序列分析,采用Neighbor-Joining(N-J)法构建系统发育进化树,同时结合链霉菌的传统形态学和生理生化特性对菌株进行鉴定。16SrDNA序列分析表明菌株与Streptomyces violaceolatus KCTC 9772相近,相似率为99%。在Neighbour-Joining法构建的系统发育进化树中,该菌株与Streptomyces violaceolatus聚类在同一分枝上。因此将该菌株鉴定为紫边链霉菌Streptomyces violaceolatus。     

一株杀黄孢链霉菌IMB-14的分离与鉴定

采用薄膜过滤法从武当山采集土壤中分离到一株具有广谱抗菌活性的链霉菌, 命名为IMB-14。通过对其抗菌活性、形态特征、培养特征、生理生化特性和16S rDNA 序列的多相分类研究, 结合代谢产物的性质鉴定该菌株为杀黄孢链霉菌(Streptomyces xanthocidicus)。该杀黄孢链霉菌的分离鉴定为新型抗菌及其抗癌活性物质的筛选奠定了基础。     

菌种1137116S rRNA序列分析及鉴定

通过PCR方法扩增菌种11371的16S rRNA基因并测序,将序列提交GenBank(登录号:DQ531606),并与其他链霉菌属种进行比较,通过DNAStar软件得到菌种16S rRNA基因序列进化树。同时采用插片法、显微镜观察等方法对株菌11371进行形态特征、培养特征、生理生化特征鉴定。结果表明,11371的16S rRNA序列与其他链霉菌具有一定的同源性,结合生理、生化指标鉴定结果,进一步确定菌种为不吸水链霉菌一株新亚种(Streptomyces ahygroscopicus subsp.wuzhouensis n.sub-sp.),菌株11371 16S rRNA序列为GenBank中首例Streptomyces ahygroscopicus的16S rRNA序列。     

一株产蓝色素链霉菌18-A-5的鉴定与系统发育分析

从原始热带雨林土壤中,分离到一株产蓝色色素菌株18-A-5,对其进行了系统分类学研究。形态学特征观察表明,在高氏合成一号培养基上初产蓝绿色色素,日久为深蓝色,基内菌丝蓝色,气生菌丝灰白色,产灰色孢子,孢子丝直或柔曲,形成长孢子链,孢子圆柱形。其DNA的G＋C摩尔分数为62.4%,16S rDNA序列分析结果(GenBank登陆号为EU054353),18-A-5与生靛链霉菌Streptomyces indigoferus ATCC23924^T 、草绿色链霉菌Streptomyces herbaricolor ATCC23924^T具有极高的同源性,达100％,聚类分析表明,18-A-5与生靛链霉菌Streptomyces indigoferus、草绿色链霉菌Streptomyces herbaricolor两株菌聚类在一起,分支置信度为74%。结合生理生化特性、细胞壁化学组成分析、脂肪酸分析等将菌株18-A-5定名为草绿色链霉菌Streptomyces herbaricolor。并对该蓝绿色可溶性色素性质进行了耐酸碱性、热稳定性、抗菌谱等初步分析。     

链霉菌ZG0429的分类鉴定与链霉亲和素的分离纯化研究

从土壤中筛选得到1株高产链霉亲和素的放线菌ZG0429,根据形态观察、培养特征、生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,初步判定该菌株为链霉菌属中的淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。经发酵,ZG0429的链霉亲和素产量可达201.0mg/L。进一步采用硫铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,链霉亲和素的回收率为76.87%,纯度可以达到97.03%。该方法简单易行,成本低廉,可得到高产量、高纯度、高活性的目的蛋白,为链霉亲和素发酵产品的大规模纯化提供了依据。     

链霉菌属的两个新种

从陕西省武功县的土壤中分离到二株链霉菌,编号为78一113和78一118。其气生菌丝体分别为淡蓝及浅灰蓝,基内菌丝体为蓝色和棕色。螺旋形孢子丝随着培养过程逐渐盘卷成球形或亚球形的团状体,未观察到硬的孢囊壁,类似假孢囊,盘卷的分生孢子链清晰可见。经鉴定,认为是链霉菌属的两个新种,命名为蓝色假孢囊链霉菌(Streptomyces cyaneo-pseudosporangiusn.sp.)和微蓝灰假孢囊链霉菌(Streptomyres plumbeo-pseudosporangius n．Sp．)。     

大肠杆菌-链霉菌高效接合载体的构建及其应用

以链霉菌质粒SCP2^*的衍生质粒pHJL400为基础,构建了能够在大肠杆菌到链霉菌之间进行高效接合转移的质粒DGH112。pGH112含有在大肠杆菌和链霉菌中复制起始位点,以及分别在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的抗性标记。用pGH112转化Escherichia coli ET12567(pUZ8002)后,与天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor A3(2))、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans TK54)、毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini NRRL15443)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces．vertezuelae ISP5230)和红色糖多孢菌(Saccharopolypora erythraea)进行接合,发现本构建的pGH112与pKC1139相比,接合转移效率较高,稳定性好,而且宿主范围较广。把组成型启动子ermE^*与绿色荧光蛋白基因(gfp)克隆到本构建的pGH112,通过接合转移到链霉菌中,gfp获得表达,证明其可以用作基因接合转移的有效工具载体,这为研究链霉菌的基因功能创造了有利条件。     

灰黄链霉菌的一个新亚种

在研究敦煌壁画微生物生态学的过程中,从257窟分离到一株链霉菌,编号为25706.该菌株在合成琼脂上气丝为黄白色,孢子丝柔曲或松螺旋,所产生的抗生素对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有较强的抑制作用.经鉴定,该菌株为灰黄链霉菌的一个新亚种,命名为灰黄链霉菌敦煌亚种.     

Interactions and biocontrol of pathogenic Streptomyces strains co-occurring in potato scab lesions

Aims:  To test interactions between pathogenic strains of Streptomyces turgidiscabies , S. scabies and S. aureofaciens . To study biological control of S. turgidiscabies and S. scabies using the nonpathogenic Streptomyces strain (346) isolated from a scab lesion and a commercially available biocontrol agent ( S. griseoviridis strain K61; 'Mycostop').
Methods and Results:  Pathogenic strains of S. turgidiscabies and S. aureofaciens inhibited growth of S. scabies in vitro , whereas strain 346 and S. griseoviridis inhibited the pathogenic strains and were subsequently tested for control of scab in the greenhouse and field. Strains 346 and K61 suppressed development of common scab disease caused by S. turgidiscabies in the greenhouse. Strain 346 reduced incidence of S. turgidiscabies in scab lesions on potato tubers in the field.
Conclusions:  Streptomyces turgidiscabies shows antagonism against S. scabies that occurs in the same scab lesions and shares the ecological niche in the field. Biocontrol of S. turgidiscabies is possible with nonpathogenic Streptomyces strains but interactions may be complicated.
Significance and Impact of the Study:  Streptomyces turgidiscabies may have potential to displace S. scabies under the Scandinavian potato growing conditions. Biological control of the severe potato scab pathogen, S. turgidiscabies , is demonstrated for the first time. The results can be applied to enhance control of common scab.     

添加胰蛋白酶促进Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加胰蛋白酶对Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明,添加胰蛋白酶可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活。摇瓶培养中,在发酵起始时添加200U/ml的胰蛋白酶,谷氨酰胺转胺酶的酶活最高达到了6.61U/ml,比对照提高了27.1%。初步研究表明,添加胰蛋白酶可以直接切割发酵过程中产生的酶原,使其被快速地转化为成熟酶,因此推测胰蛋白酶提高谷氨酰胺转胺酶酶活的原因是解除了酶原的产物抑制作用,产生更多的酶原,从而促进了产酶。     

添加CTAB促进吸水链霉菌产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明,添加CTAB可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活,摇瓶培养中,CTAB的最佳添加时间和添加量分别为32h和1%,发酵终了时,谷氨酰胺转胺酶酶活最高达5.04u/mL,比对照提高了21.8%。初步研究表明,CTAB的主要作用是促使谷氨酰胺转胺酶的酶原转化为成熟酶,因此,在发酵过程中添加适当浓度的CTAB,可使酶原快速、完全地转化为成熟的MTG,解除酶原的产物抑制作用,促进了细胞产酶。     

农用抗生素2—16产生菌的分类鉴定

在筛选新农抗的过程中,一株编号为２１６的链霉菌,它产生的次级代谢产物对多种植物病害的病原真菌有较强的抑制作用。经过两年的田间试验表明,对油菜菌核病防效较好,１５０倍分别为８３．６４％和８６．７７％,现正在研制之中。为此,对农抗２１６菌种进行分类鉴...     

转座子Tn4560在吸水链霉菌应城变种中的转座

Tn4556是在弗氏链霉菌UC8592中发现的一个类似于Tn3的转座子,在它转坐的非必需区中间插入紫霉素抗性基因vph所组成的复合体(Tn4556::vph),称为Tn4560.把Tn4560克隆到一个温敏性质粒pMT660(由PIJ702衍生而来)构建的重组质粒(pMT660::Tn4560)称为pUC1169.pUC1169不能直接转化吸水链霉菌应城变种1O-22,但可以以一定的频率转化其衍生菌株Q105(至少丧失了一个内源质粒的受体菌株.)从转化子中检测DNA,可以观察到完整的PUC1169的存在(仍为高拷贝).将携带了pUC1169的Q105菌株的孢子悬液以一定的稀释度涂布到无抗生素的平板上获得单个分散的菌株,把平板放在39℃下培养,待菌落长出丰满的孢子后,再分别影印到含有紫霉素和硫链丝菌素的培养基平板上,分离紫霉素抗性(vio~r)和硫链丝菌素敏感(thio~s)的菌落,即为pMT660“自杀”,而Tn4560在细胞中发生了转座的个体.从18个这类菌落中提取总DNA,经PvuⅡ酶解后,在琼脂糖凝胶上电泳,把电泳后的DNA转移到硝酸纤维膜上,与非放射性方法标记的pUC1169探针杂交揭示,每一个衍生菌…     

链霉菌育种进展

链霉菌是放线菌中最重要的一属,它产生绝大部分抗生素和其它众多活性物质。随着分子生物学的发展,链霉菌育种技术也日益多样。本文从基因突变与育种,遗传重组与育种、基因表达调控与代谢调节育种、基因工程与定向育种等四个方面综述链霉菌育种的进展。     

瑞拉菌素产生菌的鉴定

自陕西秦岭太白山土壤中分离到 1株编号为S 5 12 0的放线菌。根据对其生物特征鉴定、生理生化特征分析 ,它与链霉菌属中委内瑞拉链霉菌最为相近 ,但菌种S 5 12 0对梨黑星病菌、苹果腐烂病菌等多种引起植物病害的病原真菌有拮抗和溶菌作用 ,故认为S 5 12 0是委内瑞拉链霉菌的一个新变种 ,定名为委内瑞拉链霉菌秦岭变种(Streptomycesvenezuelaevar .qinlingensis.n .Var)。     

一种产生纤溶酶的链霉菌C-3662的鉴定及发酵研究

对一株从土壤中分离的纤溶酶产生菌链霉菌C-3662的形态、培养、生理生化和化学分类特征进行了研究,发现其与泛温链霉菌(Streptomyces eurythermus Corbaz et al. 1968)的特征很相符。通过对链霉菌C-3662的16S rDNA序列进行测定与比对,发现它与泛温链霉菌的16S rDNA序列也有高达98.19%的同源性。根据多相分类原则,认为链霉菌C-3662属于泛温链霉菌。对链霉菌C-3662的发酵培养基组成等的研究表明,合适的发酵培养基中应含有氮源黄豆饼粉2.0%、碳源淀粉1.0%和葡萄糖2.5%以及少量的无机盐类如硫酸镁。链霉菌C3662的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌丝体生长停止之后才大量产生。     

一个可介导链霉菌PKS基因 向植物转化的杂合质粒的构建

抗生素FR-008是由链霉菌FR-008所产生的一种七烯大环内酯类抗真菌抗生素。胡志浩等已克隆了长达约105kb的FR-008聚酮合酶(PKS)基因簇,对该基因簇中相邻于pabAB基因下游的3.8kbDNA进行序列分析,找到一个多功能聚酮合酶基因的起点,与数据库中蛋白质序列的比较分析揭示出一个尚未结束的大型开读框架的存在,它与抗细菌大环内酯类抗生素-红霉素生物合成所需的Ⅰ型聚酮合酶(PKS)基因中的乙酰转移酶(AT)和β-酮酰合酶(KS)的功能结构域显示出了高度的同源性,从分子水平上证实了FR-008抗生素由Ⅰ型PKS所合成。本实验将3.8kb中的编码聚酮合酶的部分开读框架通过基因工程的方法插入植物表达载体WRG2410上,从而成功构建了表达性质粒pHZ321。