欧文氏菌和棒杆菌的属间融合研究*

研究了用原生质体融合技术获得欧文氏菌和棒杆菌的融合细胞。串联发酵Ｄ－葡萄糖产生２－酮基－Ｌ－古龙酸的第一步发酵菌株欧文氏菌ＳＣＢ２４７经０．８ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解０．５ｈ后,原生质体的形成率和再生率分别为９９．８％和２７．８％。第二步发酵菌株棒杆菌ＳＣＢ３０５８经预处理后由１．３ｍｇ／ｍＬ溶菌酶酶解２ｈ,原生质体的形成率和再生率分别为９９．５％和５６．３％。用携带氨苄青霉素抗性标记的ＳＣＢ２４７和经热灭活的ＳＣＢ３０５８为亲本,在４０％ＰＥＧ６０００和０．２ｍｏｌ／Ｌ新生磷酸钙等适宜条件下融合,融合频率为３．６×１０~(－６)。在非选择和选择培养基上连续传代十几次后,对融合子的单菌形态、染色结果、菌落形态、色泽、总蛋白量、同工酶、发酵性能等方面与亲本进行了比较。结果表明,融合子确系棒杆菌和欧文氏菌的融合细胞。摇瓶发酵结果显示,所得的３８株稳定的融合子中约４０％能转化葡萄糖为维生素Ｃ前体２－酮基－Ｌ－古龙酸。     

大叶紫花苜蓿愈伤组织原生质体再生植株

大叶紫花苜蓿下胚轴诱导的愈伤组织在继代培养基上生长快速,易于分散。继代第１２ｄ的愈伤组织原生质体的得率为６．５×１０７／ｇ鲜重。原生质体培养基为ＳＨ基本培养基,含有１．０ｍｇ／Ｌ２,４－０、０．５ｍｇ／ＬＢＡ、２．０ｇ／ＬＣＨ、２％蔗糖、６％葡萄糖、５ｍｍｏｌ／ＬＭＥＳ,培养密度为１．０×１０５／ｍＬ。培养至第１２ｄ时的原生质体再生细胞植板率为３．７％。由原生质体形成的小愈伤组织在含２．０ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ的ＭＳ固体培养基上大量增殖。增殖的愈伤组织转移至２．０ｍｇ／Ｌ２－ｉｐ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ的Ｂ５培养基上,形成体细胞胚并发育成完整植株。     

百脉根愈伤组织原生质体再生植株

百脉根无菌苗幼茎在含２．０ｍｇ／Ｌ－,２,４－Ｄ,０．１ｍｇ／Ｌ２－ｉｐ的ＭＳ培养基上诱导和继代培养愈伤组织。选取绿色松散颗粒愈伤组织分离原生质体。原生质体培养在调整珠ＫＭ８Ｐ,Ｖ－ＫＭ,ＭＳ和ＳＨ培养基上「含３００ｍｇ／Ｌ,ＣＨ,２％ＣＷ,２％蔗糖,６％葡萄糖,２．０ｍｇ／Ｌ,２,４－Ｄ,０．５ｍｇｇ／Ｌ,ＢＡ,５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ」,原生质体再生细胞均能分裂,并形成小愈伤组织,但以ＫＭ８０为     

家蚕病原球孢白僵菌的原生质体再生回复及核型分析

家蚕病原球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）原生质体的分离制备、性状及再生回复,并用脉冲凝胶电泳（ＰＦＧＥ０技术分析了其核型。以６ｍｇ／ｍＬ Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ为酶解液,０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ液（ｐＨ５．８）为渗透压稳定剂,在３０℃下轻轻振荡处理幼嫩菌丝１．５ｈ,是的生质体分离的适宜条件。原生质体的无核率为２６．５％,有核率为７３．５％,其中单核率为５３．５％。再生回复的形式可观     

无花果曲霉原生质体形成与再生条件的探讨

根据正交试验得出无花果曲霉原生质体形成的最佳条件,用１％的混合酶液（０．５％纤维素酶＋０．２５％蜗牛酶＋０．２５％溶菌酶）作用无花果曲霉菌体细胞,原生质体产量达３．２×１０７个·ｍｌ－１,渗透压稳定剂为０．６ｍｏｌ·Ｌ－１ＫＣｌ于０．２ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＯ３＋４（ｐＨ５．８）中,酶解时间和酶解温度分别为３．０ｈ、３０℃．比较不同酶解时间、再生稳定剂和碳源等因素对原生质体再生的影响,可确定最佳再生条件,再生率达３０％以上．     

新月弯孢霉原生质体制备及再生条件的研究

以从自然界中筛选的新月弯孢霉（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）Ｄ－１为出发菌株,进行原生质体制备及再生条件的研究。将培养至１６ｈ的Ｄ－１菌丝体经ＤＴＴ溶液处理３０ｍｉｎ后,用溶壁酶和纤维素酶的混合酶液于３０℃下酶解４ｈ,原生质体释放量达到６．０×１０^６个／ｍＬ,原生质体再生率为８．３％。     

沉淀剂YNB99-1在肝素钠精制中的应用

在ｐＨ３．０时,去除８５和９５￣１０５ＵＳＰ ｕ／ｍｇ粗品肝素钠的杂蛋白分别使用０．０５％和０．０３％的ＹＮＢ９９－１。１２０ＵＳＰ ｕ／ｍｇ以上的粗品在ｐＨ中性下直接使用０．０５％的ＹＮＢ９９－１即可。在氧化精制中,加入０．００５％的ＹＮＢ９９－１可使Ｈ２Ｏ２用量减少至１．５％,氧化时间缩短到１２ｈ。精品效价１７０ＵＳＰ ｕ／ｍｇ以上,产品收率９０％以上。     

甘薯叶柄原生质体有效植株再生

将甘薯（Ｉｐｏｍｏｅａｂａｔａｔａｓ（Ｌ．）Ｌａｍ．）‘元气’和‘白星’（‘ＷｈｉｔｅＳｔａｒ’）的叶柄原生质体培养在含有０．０５ｍｇ·Ｌ－１２,４Ｄ和０．５ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ的改良ＭＳ液体培养基中,３～４ｄ后细胞开始分裂。培养８～９周后,将直径达１～２ｍｍ的愈伤组织转移到添加０．０５～０．２ｍｇ·Ｌ－１２,４Ｄ和０～０．５ｍｇ·Ｌ－１ＫＴ或添加０．５～２．０ｍｇ·Ｌ－１ＮＡＡ和１．０～３．０ｍｇ·Ｌ－１ＢＡＰ的ＭＳ固体增殖培养基上使其增殖。转移３～５周后,将愈伤组织再转移到ＭＳ基本培养基或转移到添加２．０～３．０ｍｇ·Ｌ－１ＢＡＰ的ＭＳ培养基上。当进一步转移到ＭＳ基本培养基上后,从愈伤组织或从愈伤组织形成的不定根上再生出植株。‘元气’植株再生率高达６０．０％,ＷｈｉｔｅＳｔａｒ高达４３．４％。     

决明组织培养的研究

以草决明无菌苗子叶为外植体,接种于７类诱导愈伤组织的培养基上：Ａ．ＭＳ＋２．０２,４－Ｄｍｇ／Ｌ（以下单位省略）＋０．３ＢＡ＋０．２ＮＡＡ．Ｂ．ＭＳ＋０．２２,４－Ｄ十０．２ＢＡ＋２．０ＮＡＡ．Ｃ．ＭＳ＋１．０２,４－Ｄ＋０．５ＢＡ＋０．２ＫＴ．Ｄ．ＭＳ＋０．７ＢＡ＋１．５ＮＡＡ＋０．１ＫＴ．Ｅ．ＭＳ＋１．５２,４－Ｄ＋０．７ＢＡ十０．２ＭＡＡ．Ｆ．ＭＳ＋０．４２．４－Ｄ＋１．０ＮＡＡ＋０．１ＫＴ．Ｇ．ＭＳＢ（ＭＳ的无机成份和Ｂ５有机成分）＋０．１５ＮＡＡ＋ＢＡ,ＫＴ和ＺＴ各０．５。８～１５天后分别有９０～９９．６％的子叶片被诱导出愈伤组织,并且Ｆ．与Ｃ．类培养基对诱导愈伤组织比较理想,放于Ｇ培养基上的愈伤组织有９．２～３０．２％的芽分化率。芽在生根培养基１／２ＭＳ＋０．２ＩＢＡ中、９８％生根,形成完整的再生植株。     

党参原生质体再生植株

党参下胚轴愈伤组织原生质体在附加１．２ｍｇ／Ｌ２,４－Ｄ,０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ,０．２ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ和０．１ｍｇ／Ｌ ＺＴ的ＭＳ,Ｃ８１Ｖ,ＤＰＤ及ＫＭ８ｐ培养基中进行液体体层培养。在ＫＭ８ｐ中获得了最高的分裂频率。葡萄糖作渗透剂优于甘露醇,两结合使用效果更好。在合适的条件下,原生质体培养３天出现第１次分裂,４周内形成大细胞团,培养６周后形成０．５－１．０ｍｍ大小的小愈伤组织。在附加２％蔗糖     

氮源对钝齿棒杆菌谷氨酰胺合成酶的调节作用及溶菌酶对破壁作用的研究

钝齿棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｅｎａｔｕｍ）６２８２谷氨酰胺合成酶（ＧＳ）的合成显著受氮源性质的影响,以５０ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸钠为唯一氮源时,谷氨酰胺合成酶活力最高;ＮＨ对谷氨酰胺合成酶的合成有阻遏作用,谷氨酸钠则具有解阻遏作用。蛋清溶菌酶对于菌株６２８２的细胞超声波破碎具有良好的辅助作用;适宜的细胞破碎条件为０．８ｍｇ／ｍｌ溶菌酶,３７℃保温４～５ｈ,超声波１２０Ｗ处理１２ｍｉｎ。     

可乐茄叶肉原生质体培养再生植株

本文报道茄属果树可乐茄（ＳｏｌａｎｕｍｑｕｉｔｏｅｎｓｅＬａｍ．）叶肉原生质体的分离、培养及植株再生。幼嫩叶片原生质体经酶游离、纯化后,以１×１０４个／ｍｌ密度培养于稍加改良Ｋ８ｐ（附加２,４－Ｄ０．５ｍｇＬ（－１）、ＮＡＡ１．０ｍｇＬ（－１）和ＢＡ０．５ｍｇＬ（－１））的培养基中,三天后开始分裂,一周分裂３—４次。一个月形成小细胞团,植板率为０．１—０．２％,小细胞团转培养于ＭＳ＋２,４－Ｄ０．５ｍｇＬ（－１）上增殖后进行分化。原生质体来源愈伤组织在ＩＡＡ（０．１—１．０ｍｇＬ（－１））与ＢＡ或ＺＴ组合的培养基中能诱导器官发生,芽分化率最高可达４２．９％;但ＩＡＡ、ＢＡ、ＺＴ三者一起使用未见任何器官分化。小芽在ＭＳ＋ＩＡＡ０．２ｍｇＬ（－１）中生根成植株。可乐茄叶肉原生质体的植株再生,可应用于育种和茄属植物遗传工程研究。     

向日葵下胚轴原生质体高频率愈伤组织形成与根发生

向日葵籽苗下胚轴原生质体,培养在含有ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ,２,４－Ｄ０．５ｍｇ／Ｌ,ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ和葡萄糖０．５５ｍｇ／Ｌ的改良Ｋａｏ培养基中,２４～２８ｈ后,原生质体开始分裂。包埋在琼脂糖０．６％中的原生质体,培养５ｄ后,分裂频率达９５％以上。生长旺盛的小愈伤组织转移到含有２ｉｐ０．１ｍｇ／Ｌ,ＩＡＡ０．０１ｍｇ／Ｌ,腺嘌呤４０ｍｇ／Ｌ和ＧＡ３０．０１ｍｇ／Ｌ的Ｔｈｏｍｐｓｏｎ液体培养基上１３ｄ后,原生质体诱导的少数愈伤组织发生根分化。     

芽孢杆菌M50产生β—甘露聚糖酶的条件研究

从土壤中分离到９株产生β－甘露聚糖酶的芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．Ｍ５０２５０ｍＬ三角瓶摇瓶培养试验,以４％的魔芋粉为碳源,１．０％（ＮＨ４）２ＳＯ４为氮源,０．３５％Ｎａ２ＣＯ３,３０～３４℃培养６０ｈ产酶达到高峰。酶活力为１８０～２２０ｕ／ｍＬ。１００Ｌ罐发酵,在３０～３２℃,１：０．７５ｖｖｍ通气量,２００ｒ／ｍｉｎ条件下,发酵液酶活力高达３３０ｕ／ｍＬ。     

聚β—羟基丁酸产生菌Z5—GⅡ发酵条件的研究

对聚β－羟基丁酸（ＰＨＢ）产生菌Ｚ５－ＧⅡ的发酵培养基及发酵条件进行优化研究;结果表明：该菌株在蔗糖１％,酵母粉０．３％,酵母浸汁０．３％,Ｋ２ＨＰＯ４０．２％;ｐＨ７．２￣７．４的优化发酵培养基中,接种量８％,种２８ｈ,发酵培养３６ｈ,细胞干重为６．８７ｇ／Ｌ,ＰＨＢ产率可达的细胞干重的６１．８６％。该菌株还可利用葡萄糖生产废液为碳源生产ＰＨＢ,具有实现工业化生产的潜力。     

芽孢杆菌A-30产碱性β-1,4-聚糖酶固体发酵研究

筛选得到一株高产β－１,４－聚糖酶的耐碱性芽孢杆菌Ａ－３０,其固体发酵（Ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＳＳＦ）时最适培养条件：起始ｐＨ为８．０、培养温度为３２℃、１０％（ｖ／ｗ）接种量,含水量为６６．６％（ｖ／ｗ）,以０．５％的ＮａＮＯ３为无机氮源,发酵９６ｈ,木聚糖酶活可达６４５７ＩＵ／ｇ（Ｄｒｙｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｒａｎ）,纤维素酶活（ＣＭＣａｓｅ）可以达到１８．６６ＩＵ     

L－异亮氨酸产生菌选育的研究

以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７为出发菌株,经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、紫外线（ＵＶ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级诱变处理,α－氨基－β－羟基戊酸（ＡＨＶ）、Ｓ－２－氨基乙基－Ｌ－半胱氨酸（ＡＥＣ）、磺胺胍（ＳＧ）、乙硫氨酸（Ｅｔｈ）、α－氨基丁酸（α－ＡＢ）、异亮氨酸氧肟酸（ＩｌｅＨｘ）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为碳源平板定向筛选,获得一株Ｌ－异亮氨酸高产菌ＺＱ－４（ＡＨＶ~γ、ＡＥＣ~γ、ＳＡＭ~γ、ＳＧ~γ、Ｅｔｈ~γ、α－ＡＢ~γ、ＩｌｅＨｘ~γ）在含１３．５％葡萄糖培养基中,摇瓶发酵７２ｈ、Ｌ－异亮氨酸积累可达２．８－３．０％。     

氮源对钝齿棒杆菌谷氨酰胺合成酶的调节作用及溶菌酶对破壁作用…

钝齿棒杆菌６２８２谷氨酰胺合成酶的合成显著受氮源性质的影响,以５０ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸钠为唯一氮源时,谷氨酰胺合成酶活力最高;ＮＨ４＾＋对谷氨酰合成酶的合成有阻遏作用,谷氨酸钠则具有解阻遏作用,蛋清溶菌酶对于菌株６２８２的细胞超声波破碎具有良好的辅助作用,适宜的细胞破碎条件为０．８ｍｇ／ｍｌ溶菌酶,３７℃保温４￣５ｈ,超声波１２０Ｗ处理１２ｍｉｎ。     

康宁木霉液体深层发酵生产纤维素酶

以康宁木霉（ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ） Ｔ２１５为生产菌,在 ３０ｔ气升式发酵罐中进行了液体深层发酵生产纤维素酶的扩大试验。一、二级罐种子培养基由８％麦麸组成,种龄２４ｈ。产酶培养基由６％稻草粉,１％麦麸和１％蛋白胨组成,起始ｐＨ５．０。每罐装２２ｔ培养基,１０％接种量,通气量０．４ｖｖｍ,罐压０．０８ＭＰａ,２９℃±１℃培养 ９６ｈ。连续试验 ５批,平均发酵液酶活力： ＣＭＣ－Ｎａ活力 ７８．３ＩＵ／ｍＬ,脱脂棉活力 １.３ＩＵ／ｍＬ,水杨苷活力１.４ＩＵ／ｍＬ,滤纸活力     

L－异亮氨酸产生菌选育的研究

以黄色短杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７为出发菌株,经硫酸二乙酯（ＤＥＳ）、紫外线（ＵＶ）和亚硝基胍（ＮＴＧ）逐级诱变处理,α－氨基－β－羟基戊酸（ＡＨＶ）、Ｓ－２－氨基乙基－Ｌ－半胱氨酸（ＡＥＣ）、磺胺胍（ＳＧ）、乙硫氨酸（Ｅｔｈ）、α－氨基丁酸（α－ＡＢ）、异亮氨酸氧肟酸（ＩｌｅＨｘ）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为碳源平板定向筛选,获得一株Ｌ－异亮氨酸高产菌ＺＱ－４（ＡＨＶ~γ、ＡＥＣ~γ、ＳＡＭ~γ、ＳＧ~γ、Ｅｔｈ~γ、α－ＡＢ~γ、ＩｌｅＨｘ~γ）在含１３．５％葡萄糖培养基中,摇瓶发酵７２ｈ、Ｌ－异亮氨酸积累可达２．８－３．０％。