肠三叶因子表达载体构建及在酵母菌GS115中的表达

目的:构建肠三叶因子(ITF)的真核表达载体,并在酵母菌GS115中表达,为进一步研究ITF的生理和药理功能奠定基础。方法:通过RT-PCR获得ITF cDNA片断,将目的基因插入pPICZαA酵母表达载体,得到重组载体pPICZαA-ITF。经BspHI线性化后氯化锂转化进入GS115,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因。阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测表达蛋白。结果:经测序及PCR证实ITF cDNA准确插入酵母表达载体pPICZαA中。Tricille SDS-PAGE分析证明ITF的分子量约为14×10~3,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:成功构建了真核表达载体pPICZαA-ITF,在酵母菌GS115中表达,获得重组ITF蛋白。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

人防御素6基因的克隆、亚克隆及在酵母中的分泌表达

探讨人防御素6(HD-6)在毕赤酵母中表达的可行性,为进一步研究HD6的功能提供理论依据和实验基础。采用PCR方法,设计引物从cDNA文库中扩增出人α防御素6基因片段,并将其插入到克隆载体pMD-18T中,再与毕赤酵母表达载体pPICZαA重组,以得到重组的HD-6酵母表达载体pPICZαA/HD-6,并进行琼脂糖电泳和测序鉴定。再将构建好的毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA/HD-6经SacⅠ线性化后,应用LiCl法转化毕赤酵母菌株GS115感受态中,Zeocin平板筛选,PCR鉴定转化子。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDSPAGE分析重组HD-6的表达。从cDNA文库中扩增出的HD-6基因片断大小正确;电泳和测序结果均证明已将此片段克隆到酵母表达载体pPICZαA内;线性化的重组质粒pPICZαA/HD-6成功转化进入毕赤酵母感受态中,PCR鉴定结果与预期相符;蛋白电泳证实重组HD-6在酵母中获得分泌表达。提示重组HD-6可以在毕赤酵母中实现分泌表达。     

梅毒螺旋体膜抗原基因在毕赤酵母中的表达和蛋白纯化

以梅毒螺旋体(Treponema pallidumsubsp.pallidum)Nichols菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增梅毒螺旋体47kDa、17kDa和15kDa 3个膜抗原基因,克隆进毕赤酵母表达载体pPICZ B,构建重组表达载体pTP47、pTP17、pTP15,转化酵母菌株GS115,甲醇诱导表达。表达菌体裂解后通过镍离子亲和层析获得3个抗原与6xHis tag的融合蛋白,重组蛋白的获得量分别为His-TP15:4.8mg/L;His-TP 17:6.6mg/L;His-TP47:25mg/L,经SDS-PAGE鉴定纯度都在96%以上,ELISA鉴定均具有很好的抗原性。从而首次在毕赤酵母中表达出梅毒螺旋体膜抗原,为梅毒血清学检测方法开辟了新的抗原制备途径。     

蜂毒素基因的突变与表达及其构效关系研究

为获得保留有抗菌活性而降低溶血活性作用的蜂毒素,对其分子结构进行了改造.其中一条序列缺失Lys-7,另一条缺失Leu-9.用PCR技术获得两条新的蜂毒素基因,将其克隆到酵母表达载体pPICZα-A,获得重组质粒pPICZα-A-Mel1和pPICZα-A-Mel2.将2个重组质粒分别转化毕赤酵母菌GS115.筛选获得重组酵母菌.对重组酵母菌培养条件进行优化,在YEPD中含甘油2%,pH为7,重组酵母菌培养48h后,0.5%的甲醇诱导72h,表达目的蛋白通过Tricion-SDS-PAGE确定分子质量为5.4kD.杀菌效价分别达0.947、1.085.结果表明两条蜂毒素基因成功的在毕赤酵母中表达,经突变后表达的蜂毒素降低了溶血活性,同时保留了抗菌活性.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达*

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT-PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris-EGⅣ1。在甲醇     

鸡neurexophilin 1基因在毕赤酵母中的表达

Neurexophilin 1是母鸡子宫阴道结合部位的差异表达基因。根据鸡nxph1的序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性,合成nxph1基因,设计引物以合成基因为模板,扩增其去除信号肽的DNA序列△nxph1,将合成的nxph1基因及去除信号肽的nxph1基因片段△nxph1分别插入pPICZαA真核表达载体,构建重组表达质粒pPICZαA/nxph1和去除信号肽的重组表达质粒pPICZαA/△nxph1,电转入毕赤酵母GS115,阳性菌用终浓度为1%的甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测表达产物,结果表明重组菌成功分泌鸡NXPH1蛋白和去除信号的△NXPH1蛋白,大小约29 kD,为探索NXPH1在母鸡生殖道内的功能奠定基础。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

毕赤酵母表达gp96-scFv抗体及生物活性测定

旨在利用毕赤酵母分泌表达gp96-scFv抗体,纯化后得到能特异性结合gp96抗原的小分子抗体片段(scFv)。根据gp96-scFv抗体基因序列,合成gp96-scFv抗体基因序列,将gp96-scFv抗体序列克隆到毕赤酵母表达质粒pPICZα-A,线性化的重组表达载体电转化到毕赤酵母X33,甲醇诱导目的蛋白表达,通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。通过Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法对gp96-scFv抗体的生物活性进行了检测。结果成功地构建了分泌表达抗gp96蛋白scFv抗体的毕赤酵母菌,每升毕赤酵母菌培养上清经纯化可获约50 mg gp96-scFv抗体,所获抗体其分子量大约为15 kDa,具有与gp96抗原特异性结合的活性。本研究通过毕赤酵母菌成功表达了gp96-scFv抗体,生物活性Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS分析表明该抗体能特异性结合gp96。     

人Tumstatin在毕赤酵母中的表达和活性分析

利用PCR技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin的cDNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,获得的重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选,得到可分泌表达人tumstatin的重组酵母转化子,表达蛋白质的相对分子量约30kD,表达量约25mg/L。表达上清经超滤浓缩和离子交换法初步纯化,所得产物具有免疫活性,能够抑制内皮细胞增殖,诱导其发生细胞凋亡,并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。     

4Aβ_(15)基因在毕赤氏酵母中的分泌表达及初步纯化

以pQE4Aβ15为模板,PCR扩增4Aβ15基因,并克隆到pMD18T载体中.以之进一步构建了酵母表达载体pPICZα4Aβ15.通过电转化,重组质粒pPICZα4Aβ15被整合到毕赤氏酵母GS115基因组中.甲醇诱导GS115/pPICZα4Aβ15表达,得到重组蛋白.SDS-PAGE显示重组蛋白的分子质量为18 kD,而4Aβ15的分子质量理论值为8 kD,经Western blot和质谱分析证实重组蛋白为4Aβ15.毕赤氏酵母GS115/pPICZα4Aβ15工程菌发酵上清经60%饱和硫酸铵沉淀初步纯化,获得纯度为80%的重组4Aβ15.     

人LNα4LG4-5在毕赤酵母中的表达研究

为实现人层粘连蛋白α4链LG4-5组件(Human Laminin Alpha4Chain LG4-5Module,hLNα4LG4-5)蛋白的分泌表达,采用DNA重组技术将hLNα4LG4-5cDNA片段插入分泌型酵母表达载体pPICZαA中,构建了相应的重组表达质粒pPICZαA-LG45并在GS115毕赤酵母菌株中表达,纯化蛋白后进行细胞学实验证明,hLNα4LG4-5有明显促进肿瘤细胞粘附和扩展的作用,为深入研究LG4-5组件结构与功能奠定了基础。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.     

PTD-NPY融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

应用重叠延伸PCR方法扩增HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)与鼠源神经肽Y(NPY)的融合基因,克隆目的片段并插入酵母表达载体pPICZαA,构建成重组表达质粒pPICZα-PTD-NPY.PCR和酶切鉴定及测序正确后,经限制性内切酶Sac Ⅰ线性化重组表达质粒并通过电转化整合到巴斯德毕赤酵母菌GS115的染色体基因组中.阳性重组酵母菌用含1%甲醇的培养基诱导其分泌表达.经过120 h的诱导,取上清浓缩除盐后进行SDS-PAGE电泳,表明该系统成功表达了PTD-NPY融合蛋白,Western blotting实验证实表达产物具有特异性.获得真核表达的PTD-NPY融合蛋白,为下一步的应用研究提供了物质基础.     

恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型恶性疟疾疫苗的侯选抗原,在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白,并对表达产物进行鉴定。方法:参照GenBank中公布的pfs25基因序列,通过毕赤酵母喜好密码子分析人工合成目的基因;采取定向克隆策略构建重组表达质粒pfs25/pGAPZαA,经BstXⅠ线性化,电转染法转化酵母菌株GS115,在Zeocin抗性的筛选培养基上获得表达目的基因的pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物;通过在YPD培养基上传代培养和目的基因表达,验证重组菌株的遗传稳定性。结果:在毕赤酵母中表达了Pfs25蛋白,且重组菌株遗传性质稳定。结论:为研制基于Pfs25蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。     

里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ在毕赤酵母中的高效表达

本工作采用巴氏毕赤酵母Pichiapastoris表达系统进行了里氏木霉Trichodermareesei纤维二糖水解酶Ⅱ(CellobiohydrolaseII)的表达。用RT-PCR的方法从经稻草粉诱导的里氏木霉培养物中分离出纤维二糖水解酶Ⅱ的基因,将其插入到巴氏毕赤酵母的表达载体pPICZαA中,并使之处于α-因子信号肽序列的下游,得到重组质粒pPICZαA-cbh2。通过电穿孔的方法用线性化的pPICZαA-cbh2转化巴氏毕赤酵母GS115菌株,经过大量筛选后得到可以高效表达纤维二糖水解酶的毕赤酵母菌株P.pastorisCBHⅡ1。在甲醇诱导的条件下培养P.pastorisCBHⅡ1,培养液中的CMC活性可达到3.82U/mL,SDS-PAGE分析结果表明纤维二糖水解酶在P.pastorisCBHⅡ1中的表达量远远高于里氏木霉。对表达产物进行了LC-MS分析,结果表明所表达的蛋白为里氏木霉的纤维二糖水解酶。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较*

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白(Core),将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBRTM/HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20%;在酵母培养上清     

一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达

利用PCR技术扩增出pPIC9K载体的HIS4 Kan序列片段 ,与pPICZα重组 ,构建结合了两个载体特点的适合体外构建多拷贝基因表达盒的毕赤酵母表达载体pPICZα1,改造后的载体含HIS4 Kan序列 ,能整合到酵母染色体上 ,具有筛选方便、外源基因多拷贝组建迅速、蛋白产物分泌表达和易纯化等优点。将人脑源性神经营养因子(hBDNF)的cDNA(35 7bp)克隆入载体pPICZα1,利用同尾酶BglⅡ、BamHⅠ不可逆连接方式 ,分别构建含有 1、2、3、6个拷贝hBDNF表达盒的重组表达载体 ,电击法转化毕赤酵母GS115菌株 ,用G4 18和Zeocin筛选转化子 ,筛选到的阳性转化子用 0 5 %甲醇诱导 ,获得分泌型表达。表达产物类似于天然神经营养因子单体大小、分子量约 14kD。多拷贝hBDNF表达盒的表达水平亦高于单拷贝hBDNF表达盒 ,ELISA和Westernblot检测表明 :表达的蛋白能与鸡抗人脑源性神经营养因子抗体特异结合 ,证实该表达蛋白具有hBDNF的免疫原性