盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因（ThGPX6）的克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶在植物响应盐胁迫中具有重要作用。依据盐芥EST序列进行RACE实验,获得1个新的谷胱甘肽过氧化物酶基因,命名为ThGPX6(GenBank注册号为FJ357244)。该基因的cDNA全长892 bp,包含1个长为702bp的开放读码框,编码234个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白具有植物GPX的典型结构,即GPX催化活性区(NVASKCGLT)和标志性基序(ILAFPCNQF),以及PHGPX特有序列(KWNF(S/T)KFL)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ThGPX6在盐芥叶片和根中表达,其表达受NaCl诱导,显示ThGPX6在植物高盐响应中发挥作用。亚细胞定位结果表明,ThGPX6存在于线粒体和内体中的可能性最大,预示着ThGPX6在清除ROS过程中起着重要作用。     

胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv.)具有极强抗盐碱能力。本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示:盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因(PeGPX)的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用。为分析 GPX 对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用 RT-PCR 方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系。研究结果显示,实验中克隆的 cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其 ORF 为 693 bp,其蛋白由 231 个氨基酸编码。过量表达 PeGPX 基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加 NaCl(200 mmol/L)的 MS 培养基中生长 15 d 后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达 PeGPX 基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率。酶活数据显示,转基因株系 GPX 酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高。我们的研究结果说明:过表达 PeGPX 基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。     

过量表达GST基因对盐胁迫下转基因拟南芥氧化损伤的影响

利用模式生物拟南芥作为实验材料,通过测定谷胱甘肽-抗坏血酸代谢相关酶（GST、GPX、APX、GR、DHAR、MDHAR）的活性和GSH、ASA、MDA含量以及生物量等来研究过量表达具有过氧化物酶活性的盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因（GST基因）对盐胁迫下转基因拟南芥氧化损伤的影响。结果显示,转基因拟南芥比野生型具有较高的GST、GPX以及MDHAR酶活性;前者还具有较多的还原型谷胱甘肽和抗坏血酸,并且谷胱甘肽库氧化水平较野生型高。盐胁迫不但部分抑制了野生型拟南芥的生长,同时也导致了大量脂质过氧化物的积累;而盐胁迫对转基因拟南芥的生长抑制不明显,也没有较多的脂质过氧化物的积累。结果表明,过量表达盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶基因提高．广转基因拟南芥依赖于还原型谷胱甘肽的过氧化物清除途径,同时有可能改变了GSH和ASA的代谢途径,这两方面的作用导致了转基因拟南芥氧化损伤的降低,使转基因拟南芥在盐胁迫下保持较好的生长态势。     

二氧化硫胁迫导致拟南芥防护基因表达改变

研究SO2熏气对拟南芥细胞中mRNA和蛋白质表达的影响,分析植株对逆境胁迫的响应机制.结果表明,30 mg·m-3 SO2 熏气72 h后拟南芥地上组织中差异表达1倍以上的基因有494个,其中抗氧化酶、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、硫氧还蛋白等多种与逆境生理关系密切的基因表达上调;2.5～30 mg·m-3 SO2 熏气可导致超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和GST的活性诱导性增高,SOD、CAT同工酶谱带特征改变.研究结果表明,SO2 胁迫能够诱导拟南芥中防护基因在mRNA和蛋白质表达水平的改变,这些基因的差异性表达可能对逆境生理过程有益.     

丹参转录因子SmMYB7的克隆及表达模式分析

分析丹参转录组数据库(SRX021907),得到一条R2R3-MYB基因,blast比对发现该基因为丹参Sm MYB7(KF059361.1)。分别从g DNA和c DNA水平克隆该基因全长,测序结果表明该基因与公布序列一致,分析发现该基因无内含子序列,包含一个长为954 bp的开放读码框(ORF),编码317个氨基酸残基。多重序列比对和系统进化树分析显示Sm MYB7蛋白与拟南芥At MYB73同属R2R3-MYB第22个亚家族。已有丹参基因信息结合BD walking获得1 974 bp的启动子序列,分析结果表明多种顺式作用元件存在于该基因的启动子区。实时荧光定量PCR分析显示,该基因的表达为组成型,在丹参根、茎、叶、花中都表达;随着花的发育,该基因的表达量逐渐增加;此外,Sm MYB7在盐胁迫、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下表达均上调,推测该基因参与调控植物防御和花的发育。     

草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性为95.8%,与鳗鲡GPX1(GenBank acces-sion No.ACN78878)的为84.8%,与哺乳类的为59%~72%。采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测草鱼GPX1的组织表达特征。结果表明,草鱼GPX1的mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝、鳃和肾表达水平较高,在红肌、脂肪和肠道中表达水平较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类GPX1基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

小立碗藓GPX家族的功能分化与催化特性研究

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在植物抵抗氧化胁迫中发挥重要作用。该研究从小立碗藓(Physcomitrella patens)基因组中挖掘到3个GPX基因,分别命名为PpGPX1、PpGPX2和PpGPX3。其中PpGPX1和PpGPX3只含有1个外显子,而PpGPX2含有6个外显子。表达模式分析发现PpGPX1和PpGPX2在检测的所有条件下均表达,而PpGPX3在检测的所有条件下均不表达。蛋白亚细胞定位分析发现,PpGPX1蛋白定位在细胞质,而PpGPX2蛋白定位在叶绿体。在大肠杆菌中表达并纯化了PpGPX1和PpGPX2蛋白,酶学性质分析发现,PpGPX1和PpGPX2蛋白均只能利用Trx电子供体系统,而不能利用GSH电子供体系统;PpGPX2蛋白对过氧化物底物的催化活性和催化效率均高于PpGPX1。基因结构、表达模式、亚细胞定位和蛋白酶学性质的差异预示小立碗藓GPX基因家族成员发生了功能分化,将PpGPX2蛋白的Pro158、Phe167和Phe172氨基酸残基均突变为Ala,发现突变体蛋白对底物催化活性降低,说明这3个氨基酸位点对PpGPX2蛋白具有重要催化活性。     

马铃薯腐烂茎线虫谷胱甘肽过氧化物酶基因(Dd-Gpx)的克隆与原核表达

旨在研究植物寄生线虫谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)的结构和功能,通过RACE技术克隆了马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)Gpx基因,并成功克隆到p ET-41b载体上进行融合表达。结果表明,该基因c NDA全长950 bp,含有1个681 bp的开放阅读框,共编码226个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白N端有明显信号肽,属于分泌蛋白。将其克隆到p ET-41b载体在BL21(DE3)中进行原核表达,结果显示,在60 k D处有一条明显的带。经质谱鉴定,此条带有7个肽段与马铃薯腐烂茎线虫GPX匹配。表明重组Dd-GPX蛋白表达成功。     

拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的表达模式分析

[目的]研究拟南芥胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;At GAPDH)基因家族成员的生理功能和表达模式。[方法]利用生物信息学法分析At GAPDH1和At GAPDH2的启动子元件;借助序列克隆、植物转基因技术、以及GUS活性检测技术分析At GAPDH1和At GAPDH2在植物内表达模式。[结果]启动子序列生物信息学分析表明At GAPDH1和At GAPDH2启动子分别具有相同的和基因特异的调控元件;启动子融合GUS活性检测表明At GAPDH1和At GAPDH2具有不同的表达模式。[结论]通过对At GAPDH基因家族成员的表达模式的分析,初步确定了基因家族成员功能的特化与其序列和表达模式的相关性。     

水稻丝氨酸蛋白酶S8基因家族的分布及分析

水稻丝氨酸蛋白酶S8基因家族在水稻的生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究利用公共数据库资源,分析水稻中丝氨酸蛋白酶S8基因家族,在水稻12条染色体上找到46个该类基因。通过其结构分析发现,每个基因的内含子数目从0到10各不相同,但氨基酸序列是非常保守的,都有催化活性位点和底物结合位点。系统进化树分析显示,这46个基因分为3个亚家族,S8-1亚家族最大。该家族基因的进化主要是通过基因重复复制的方式进行,其表达模式发生了变化,并且多个基因在穗部具有表达。     

Genome-wide identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza

Terpenoids are the largest class of plant secondary metabolites and have attracted widespread interest. Salvia miltiorrhiza, belonging to the largest and most widely distributed genus in the mint family, is a model medicinal plant with great economic and medicinal value. Diterpenoid tanshinones are the major lipophilic bioactive components in S. miltiorrhiza. Systematic analysis of genes involved in terpenoid biosynthesis has not been reported to date. Searching the recently available working draft of the S. miltiorrhiza genome, 40 terpenoid biosynthesis-related genes were identified, of which 27 are novel. These genes are members of 19 families, which encode all of the enzymes involved in the biosynthesis of the universal isoprene precursor isopentenyl diphosphate and its isomer dimethylallyl diphosphate, and two enzymes associated with the biosynthesis of labdane-related diterpenoids. Through a systematic analysis, it was found that 20 of the 40 genes could be involved in tanshinone biosynthesis. Using a comprehensive approach, the intron/exon structures and expression patterns of all identified genes and their responses to methyl jasmonate treatment were analysed. The conserved domains and phylogenetic relationships among the deduced S. miltiorrhiza proteins and their homologues isolated from other plant species were revealed. It was discovered that some of the key enzymes, such as 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase, hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, and geranylgeranyl diphosphate synthase, are encoded by multiple gene members with different expression patterns and subcellular localizations, and both homomeric and heteromeric geranyl diphosphate synthases exist in S. miltiorrhiza. The results suggest the complexity of terpenoid biosynthesis and the existence of metabolic channels for diverse terpenoids in S. miltiorrhiza and provide useful information for improving tanshinone production through genetic engineering.     

丹参体内Sm-miR858对R2R3-MYB转录因子SmPAP1进行靶向负调控作用研究

MicroRNAs(miRNAs)是一类对基因表达进行负调控的非编码小分子RNA。通过前期对丹参miRNAs的高通量测序得到了一个miR858成熟序列,命名为Sm-miR858。序列比对显示,Sm-miR858与其它植物中已鉴定的miR858序列高度保守;Small RNA Northern blotting结果显示Sm-miR858在丹参根、茎和叶组织中均有表达,叶中表达水平相对较高。为了探究Sm-miR858在丹参体内的功能,首先利用在线生物软件对Sm-miR858的靶标基因进行预测,psRNATarget分析结果显示,Sm-miR858的潜在靶标基因共有13个,其中一个靶标基因SmPAP1作为一个重要的转录因子参与丹参酚酸类活性物质的代谢调控。为了验证Sm-miR858对SmPAP1的靶向作用,采用Real-time quantitative PCR依次对烟草瞬时表达体系和丹参组织器官中的Sm-miR858与SmPAP1之间共表达相关性进行分析与实验验证。Real-time qPCR结果显示,在丹参组织中SmPAP1与Sm-miR858共表达水平存在显著的负相关性。进而分别构建Sm-miR858和SmPAP1过表达植物载体,并在烟草叶片中进行瞬时共表达研究。结果显示,与对照相比,Sm-miR858过表达会导致SmPAP1的mRNA水平显著下降,说明在丹参体内Sm-miR858的确对SmPAP1基因表达进行靶向负调控。研究结果为阐明Sm-miR858在丹参体内酚酸类活性物质代谢途径调控作用奠定坚实的基础。     

Genetic diversity of Paramecium species on the basis of multiple loci analysis and ITS secondary structure models

Among ciliates, Paramecium has become a privileged model for the study of “species problem” particularly in the case of the “Paramecium aurelia complex” that has been intensely investigated. Despite extensive studies, the taxonomy of Paramecium is still challenging. The major problem is an uneven sampling of Paramecium with relatively few representatives of each species. To investigate species from the less discovered region (Pakistan), 10 isolates of Paramecium species including a standing-alone FT8 strain previously isolated by some of us were subjected to molecular characterization. Fragments of 18S recombinant DNA (rDNA), ITS1-5.8S-ITS2-5′LSU rDNA, cytochrome c oxidase subunit II, and hsp70 genes were used as molecular markers for phylogenetic analysis of particular isolates. The nucleotide sequences of polymerase chain reaction products of all markers were compared with the available sequences of relevant markers of other Paramecium species from GenBank. Phylogenetic trees based on all molecular markers showed that all the nine strains had a very close relationship with Paramecium primaurelia except for the FT8 strain. FT8 consistently showed its unique position in comparison to all other species in the phylogenetic trees. Available sequences of internal transcribed spacer 1 (ITS1) and ITS2 and some other ciliate sequences from GenBank were used for the construction of secondary models. Two highly conserved helices supported by compensatory base changes among all ciliates of ITS2 secondary structures were found similar to other eukaryotes. Therefore, the most conserved 120 to 180 base pairs regions were identified for their comparative studies. We found that out of the three helices in ITS1 structure, helix B was more conserved in Paramecium species. Despite various substitutions in the primary sequence, it was observed that secondary structures of ITS1 and ITS2 could be helpful in interpreting the phylogenetic relationships both at species as well as at generic level.     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。