草鱼过氧化氢酶全长cDNA的克隆、序列同源分析与组织表达

过氧化氢酶(catalase,CAT)是生物体内抗氧化防御系统的关键酶之一,在清除过氧化氢而避免机体产生氧化应激的过程中起重要作用.本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏中克隆了CAT完整编码序列(complete coding sequence,CDS).该CAT序列(GenBank登陆号:FJ560431)全长2 263 bp,包括完全开放阅读框(ORF) 1 575 bp、5'非编码区(UTR) 118 bp和3' UTR 570 bp.其ORF编码525个氨基酸残基,理论分子量为59.59 kD,等电点为7.02.在草鱼CAT cDNA的终止密码子附近,其3' UTR具有长且完整的AC重复序列,与斑马鱼、鲢鱼及啮齿类动物CAT的3' UTR AC重复序列相似.序列比较表明,草鱼CAT的核苷酸及推测氨基酸序列与其它多种物种的一致性均较高,其一致性分别为93.4%~43.0%和98.1%~63.3%.同时,草鱼CAT cDNA的推测氨基酸序列具有与其它动物高度保守的特征性基序,包括亚铁血红素结合信号序列"RLFSYPDTH"、酶活性中心序列"FDRERIPERVVHAKGA"及3个催化位点残基His74、Asn147和Tyr357.此外,草鱼CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与NADPH 结合位点.根据草鱼CAT基因的上述特征,推测其属于CAT基因家族中的单功能或典型CAT基因亚群.采用实时荧光定量PCR (Q-PCR)检测草鱼CAT的组织表达特征.结果显示,草鱼CAT mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝中表达水平量较高,在红肌、白肌和脂肪中表达量较低.本研究结果将有助于进一步探讨鱼类CAT基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础.     

草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性为95.8%,与鳗鲡GPX1(GenBank acces-sion No.ACN78878)的为84.8%,与哺乳类的为59%~72%。采用实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测草鱼GPX1的组织表达特征。结果表明,草鱼GPX1的mRNA在所检测的11种组织器官中均有表达,其中在肝、鳃和肾表达水平较高,在红肌、脂肪和肠道中表达水平较低。本研究结果将有助于进一步探讨鱼类GPX1基因的结构与功能,并为研究其抗氧化分子机理奠定基础。     

斑节对虾溶菌酶基因克隆及序列分析

参考对虾溶菌酶基因和类溶菌酶基因及其他多种生物的溶菌酶基因序列 ,设计并合成引物。运用RT PCR技术 ,从斑节对虾血细胞总RNA中扩增获得特异性片段。所获片段回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明 ,所克隆的斑节对虾溶菌酶基因片段长 6 5 8bp ,包括溶菌酶基因开放阅读框 (ORF)4 77bp和 3′端非编码区的 181bp。 4 77bpORF共编码 15 8个氨基酸 ,包括溶菌酶成熟肽 14 0个氨基酸残基和信号肽 18个氨基酸残基。斑节对虾溶菌酶成熟肽推测分子量为 16 ,32kd ,等电点为 8 78。与南美白对虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列比较 ,同源性分别为 89 5 %和 93 0 % ;与日本对虾类溶菌酶基因的同源性分别为 84 0 %和91 0 %。进一步的序列分析表明 ,斑节对虾溶菌酶氨基酸序列与多种类群生物的c 型溶菌酶氨基酸序列具有较高的同源性 ,并具有与c 型溶菌酶相同的活性位点氨基酸残基Glu51和Asp68,且与活性位点相邻的序列高度保守。斑节对虾溶菌酶氨基酸序列还具有与c 型溶菌酶相同的结构氨基酸——— 8个半胱氨酸残基。因而可认为所克隆的斑节对虾溶菌酶基因属c 型溶菌酶基因。     

延伸动物学实验课堂,营造创新思维场所

改革动物学实验内容,提出新颖且具创新性的问题,使教学内容丰富且与时俱进。教学方法以人为本,在教学中采用＂角色换位法＂,即鼓励学生参与实验的各个环节,并上讲台来分析实验过程与结果。几年来教学实践表明,通过教学内容与方法的改革,使实验课成为教师有意识、有计划地延伸实验课堂,营造创新思维的场所,有利于活跃实验教学氛围,培养学生的创新能力。