池蝶蚌(贝)血细胞显微观察

本文对池蝶蚌血细胞的形态结构及其动态变化进行了研究。根据血细胞形态、大小和密度等特征，把血细胞分为六类：颗粒细胞、透明细胞、浆液细胞、类淋巴细胞、梭形细胞和血栓细胞；并对各种血细胞显微结构予以描述，统计了血细胞胞体大小、细胞核大小、核质比、密度及所占比例，其中颗粒细胞所占比例最大，透明细胞次之，类淋巴细胞最少，颗粒细胞和透明细胞是两种主要的细胞类型，约占总数的82%，担负着最基本的代谢和免疫功能；通过对池蝶蚌血细胞形态的连续观察，发现血细胞存在形态变化现象，推测细胞间可能存在相互转化的情况。     

池蝶蚌线粒体基因组双单性遗传现象分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式不同于标准的母系遗传(SMI),被称为双单性遗传现象(DUI)。池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是淡水双壳贝类,是否存在双单性遗传现象?本文采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序及软件拼接获得了雄性池蝶蚌线粒体基因组(以下简称Hs-mtDNA)全序列,并与本实验室已报道的雌性池蝶蚌线粒体基因组全序列进行差异性分析。结果表明,雄性和雌性Hs-mtDNA全长分别为15961 bp和15939 bp,雄性比雌性长22 bp,雌雄线粒体基因组成与排列顺序一致。各蛋白编码基因的碱基数目均一致,碱基转换率为1.01%～7.34%,颠换率为0.00%～0.62%,氨基酸差异率为0.00%～9.35%;其中,COX1基因变异率为2.72%;COX2基因碱基变异率最高,达7.50%,雄性COX2的3'末端没有出现编码延伸区。雄性12S rRNA基因发生5 bp的碱基转换,差异率为0.6%;16S rRNA基因比雌性长9 bp,碱基差异率仅为1.2%。雌雄tRNA-His均位于H链上,介于COX2与ND3之间,没有出现位置的差异性。雌雄Hs-mtDNA的非编码区共有28个1～393 bp的片段,但未见控制区。在tRNA-Glu与tRNA-Tyr间有一段长393 bp的非编码区存在蛋白质翻译功能,但非雄性特异性蛋白。以COX1基因建立系统进化树,池蝶蚌和三角帆蚌(H.cumingii)聚在一起,而含有双单性遗传现象的无齿蚌属的Pyganodon grandis、小方蚌亚科的Venustaconcha ellipsiformis及小方形蚌属的Quadrula quadrula三者雄性聚为一支,雌性聚为一支。因此,雌雄池蝶蚌线粒体存在一定的差异性,但其差异要比其他具有双单性遗传现象的淡水双壳类小得多,且池蝶蚌线粒体遗传可能不存在双单性遗传现象。     

池蝶蚌Sox2基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用,为研究池蝶蚌中Sox基因的功能,以人SRY基因HMG-box保守区的序列设计简并引物,以雌、雄池蝶蚌基因组DNA和精巢cDNA为模板进行扩增,获得了2个不完全相同的序列,分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2和cDNA-HMG,长度均为220 bp,编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3及Sox14有很高的同源性,雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2部分cDNA片段,长度为1774 bp,该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2的同源性最高;在部分开放阅读框249个氨基酸残基中,具有Sox家族典型的HMG-box结构域,与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2的HMG-box同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8种组织hs-Sox2的表达情况,结果显示,hs-Sox2基因在8种组织中均有表达,其中在肾脏中的表达量最高,其次是肠与闭壳肌,在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺,在肝脏中的表达量最低;为了解hs-Sox2在不同性腺发育时期的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了5个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2的表达情况,结果显示在39月龄性腺的表达量最高,其次是16月龄性腺,63月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明,hs-Sox2基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。     

池蝶蚌组织蛋白酶L基因的组织表达及免疫应激分析

应用cDNA文库筛查及同源片段克隆拼接技术,克隆了池蝶蚌组织蛋白酶L(Hs-CtsL)cDNA基因全长序列(GenBank注册号为JN604558)。其cDNA全长1152 bp,5′-非翻译区(Untranslated Region,UTR)长1 bp,3′-UTR长149 bp包括1个多聚腺苷信号AATAAA和Poly(A)尾巴,开放阅读框(Open reading frame ORF)为1002 bp,编码333个氨基酸组成的多肽链。其分子量约37.7 kD,理论等电点为7.16,包含信号肽、前体域和成熟域。系统进化分析显示,Hs-CtsL同无脊椎动物组织蛋白酶L聚为一支,且同三角帆蚌亲缘关系最近,其次为褶纹冠蚌。组织表达分析结果显示,池蝶蚌组织蛋白酶L在肠、鳃、性腺、外套膜、斧足、闭壳肌、血细胞、肝胰腺、肾和心脏均有表达,其中血细胞中表达量最高。应激实验表明,经嗜水气单胞菌刺激后,Hs-CtsL在血细胞、鳃、肝胰腺和外套膜中的表达量显著上调。其中在肝胰腺中刺激后6h表达量到达峰值,在血细胞、鳃和外套膜中的表达模式近似,表现为一个波动变化,在4h、12h和48h被上调。结果暗示着Hs-CtsL除参与了池蝶蚌血细胞的先天性免疫防御以外,还参与了其消化腺免疫器官的免疫应答反应。     

温度对池蝶蚌雌雄同体和性逆转的影响

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响, 研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察, 并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化。通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRT-PCR检测, 同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位。结果显示: 在自然条件下, 6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象, 28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8%分化为雄蚌, 16.7%维持雌雄同体现象, 5.5%分化为雌蚌)。在不同温度刺激下, 14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象。32℃刺激, 14月龄雄蚌出现12.5%雌雄同体; 27℃刺激, 14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5%和12.5%性逆转; 23℃刺激, 14月龄雌蚌出现14.29%性逆转; 19℃刺激, 14月龄雌蚌出现25%性逆转。qRT-PCR结果显示: Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期, 32℃刺激, 在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度, 19℃刺激, 在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度; Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致, 与Tra2a大体一致, 在5、32月龄与Sox9相互抑制; 19℃、23℃和27℃刺激, Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度, 且23℃刺激, Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度; Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度。Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异, Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌。原位杂交技术结果显示, Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中。综上所述, 温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化, 27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象, 23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转; 并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量, 从而调节生殖滤泡分化的。     

池蝶蚌致雄性化基因fem-1c及其蛋白分子的结构特征分析

研究首次获得淡水珍珠贝池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)的致雄性化基因feminization-1C亚型,即fem-1c基因,并进行全长克隆及序列分析。从转录组中Race-PCR扩增fem-1c基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对fem-1c基因进行基因组结构分析、多序列同源性比较、跨膜区段、亲疏水性分析、功能结构域预测等。研究结果如下:该cDNA序列全长2328 bp,包含一个1869 bp的最大开放阅读框,编码622个氨基酸,经同源比对和进化树分析,fem-1基因c亚型编码的氨基酸与太平洋牡蛎的同源性最高,为79%;疏水性分析显示该蛋白为亲水性蛋白;二级结构预测发现该蛋白有大量的α螺旋和随机卷曲,形成9个锚蛋白重复序列(Ankyrin repeat,ANK),同时,三级结构预测中可以清楚的看到9个ANK模体,跟SMART预测的结构位点结果相近。从无脊椎动物到脊椎动物fem-1c基因的保守性表明它们有共同的起源,暗示这个基因家族在功能上具备保守性,推测池蝶蚌fem-1c基因可能具备与线虫fem-1基因在性别决定方面上相似的功能。     

池蝶蚌线粒体基因组全序列分析简

采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接首次获得了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为15939 bp,由13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个SrRNA基因和28个长度为1—393 bp的非编码区组成;除ND3-ND5、ND4L、ATP6、ATP8、COX1-COX3、tRNA-D、tRNA-H之外,其他大多数基因在L链编码。池蝶蚌线粒体全基因组序列、蛋白编码基因、tRNA基因、rRNA基因及非编码区的A+T含量分别为60.36%、59.84%、61.7%、60.23%及62.5%,与其他淡水蚌类一致,均表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现在非编码区长度的差异。池蝶蚌mtDNA的COX2-12SrRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNAHis、tRNAAla、tRNASer1、tRNASer2、tRNAGlu、ND2、tRNAMet 8个基因发生重组造成。22个tRNA基因都具有典型的三叶草二级结构,tRNA-E与tRNA-W间的非编码区含有一个ORF区,而控制区并未发现。从GenBank上下载的14种双壳纲贝类的mtDNA序列构建的系统进化树,显示池蝶蚌与三角帆蚌亲缘关系最近。研究结果为淡水珍珠蚌线粒体基因重排及进化特征提供理论依据。     

池蝶蚌STAT基因的克隆及功能分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)信号转导及转录激活因子STAT基因的初步功能, 通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得STAT的cDNA全长序列(GenBank ID: KY123702), 命名为HsSTAT, HsSTAT全长为2752 bp, 5′-非编码区(5′UTR)为121bp, 3′-非编码区3′UTR为264 bp, 开放阅读框(ORF)为2367 bp, 编码788个氨基酸; 生物信息学分析发现该蛋白结构域主要由STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind、SH2四个经典保守性功能域组成; 缬氨酸最多占12.9%。色氨酸使用频率为100%。二级结构中α螺旋最多占46.83%、β折叠最少占8.5%。HsSTAT蛋白亲水性指数为– 0.531, 是亲水性蛋白。预测到棕榈酰化修饰位点1个, 小泛素相关修饰序列3个, 磷酸化修饰位点22个。系统进化树分析显示, HsSTAT与光滑双脐螺STAT5B和盘鲍STAT5聚在一支; 亚细胞定位结果显示HsSTAT定位于血细胞的细胞质中; 荧光原位杂交结果显示HsSTAT主要在细胞核。qPCR结果显示HsSTAT在所有的组织中均有表达, 其在组织中的表达量在肝胰腺中最高, 在血细胞中最低。细胞增殖实验显实验组增殖率为119%, 高于对照组。实验已克隆到HsSTAT的全长序列, HsSTAT可能为STAT5亚型, 具有促进SMCC-7721细胞增殖的功能, 推测具有池蝶蚌细胞的信号转导功能参与池蝶蚌的先天免疫。     

鄱阳湖泥鳅黑色素聚集激素1基因及其蛋白结构特征分析

为研究黑色素聚集激素（Melanin-concentrating hormone,MCH）在泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）皮肤黑色素沉着过程中所起的作用,研究采用RACE-PCR技术首次克隆出了鄱阳湖泥鳅前原黑色素聚集激素1（Prepro-melanin-concentrating hormone 1,Pmch1）基因cDNA全长序列,将其命名为MaPmch1。运用生物信息学软件对MaPmch1基因及其蛋白的理化性质和结构特征进行了分析,构建了系统进化树。其cDNA全长为570 bp,存在一个长度为110 bp的CpG岛,位于263-372 bp;该基因开放阅读框共375 bp,编码含124个氨基酸的蛋白质,共有7个潜在的磷酸化位点;PMCH1蛋白经水解产生17个氨基酸的环形神经肽黑色素聚集激素1（MCH1）。PMCH1和MCH1均为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主;MCH1超二级结构具有一个反平行β-折叠片层,通过二硫键连接形成环形神经肽。同源性分析表明鄱阳湖泥鳅MCH1（MaMCH1）氨基酸序列与其他硬骨鱼类的高度一致。系统进化树显示,包括泥鳅在内的鲤形目PMCH1聚为一支,且物种间PMCH1的亲缘关系与传统的分类地位相吻合。在脊椎动物中,MCH存在高度保守的序列RCM*GRVYRPCW（*代表随机氨基酸）,证明该基因在进化上是极为保守的。     

萍乡肉红鲫的性腺发育研究

萍乡肉红鲫(Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus L.)是在江西省萍乡地区分布的天然三倍体鲫突变体经人工选育后获得的遗传性状基本稳定的后代,具有两性生殖和雌核生殖两种生殖方式.研究以F5代萍乡肉红鲫为材料,自孵化后每满1个月开始取性腺,观察了其卵巢1周年性成熟和精巢的发育过程,结果表明萍乡肉红鲫的性腺为1年成熟类型.卵巢发育进程町以分为6个时期,卵母细胞发育相应可分为6个时相.统计了卵巢成熟系数周年变化,体重为95 g左右的雌性萍乡肉红鲫,其成熟卵巢的成熟系数约为(11.73±2.8)%,成熟的卵母细胞内充满卵黄,相对怀卵量为(3018±310)粒/g.萍乡肉红鲫精巢属于小叶型,在精小叶中可观察到不同发育阶段的生殖细胞.由精原细胞分裂而来的仞级精母细胞经分裂增殖,产生次级精母细胞并最终发育成为精子.萍乡肉红鲫的精巢发育程序与普通鲫鱼和鲤鱼相似,卵巢和精巢的发育过程基本同步,孵化后50日龄内性腺分化不明显,到70日龄左右开始出现雌雄分化,3月龄发育为第1期,4-5月龄发育为第2期,6-7月龄发育至第3期,7-10月龄可见第4期卵巢,1年即可成熟产卵,精巢可排出精液.结果表明,该鲫鱼突变体的性腺发育与普通二倍体鲤(鲫)鱼的性腺发育方式类似.