池蝶蚌线粒体基因组双单性遗传现象分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式不同于标准的母系遗传(SMI),被称为双单性遗传现象(DUI)。池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是淡水双壳贝类,是否存在双单性遗传现象?本文采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序及软件拼接获得了雄性池蝶蚌线粒体基因组(以下简称Hs-mtDNA)全序列,并与本实验室已报道的雌性池蝶蚌线粒体基因组全序列进行差异性分析。结果表明,雄性和雌性Hs-mtDNA全长分别为15961 bp和15939 bp,雄性比雌性长22 bp,雌雄线粒体基因组成与排列顺序一致。各蛋白编码基因的碱基数目均一致,碱基转换率为1.01%～7.34%,颠换率为0.00%～0.62%,氨基酸差异率为0.00%～9.35%;其中,COX1基因变异率为2.72%;COX2基因碱基变异率最高,达7.50%,雄性COX2的3'末端没有出现编码延伸区。雄性12S rRNA基因发生5 bp的碱基转换,差异率为0.6%;16S rRNA基因比雌性长9 bp,碱基差异率仅为1.2%。雌雄tRNA-His均位于H链上,介于COX2与ND3之间,没有出现位置的差异性。雌雄Hs-mtDNA的非编码区共有28个1～393 bp的片段,但未见控制区。在tRNA-Glu与tRNA-Tyr间有一段长393 bp的非编码区存在蛋白质翻译功能,但非雄性特异性蛋白。以COX1基因建立系统进化树,池蝶蚌和三角帆蚌(H.cumingii)聚在一起,而含有双单性遗传现象的无齿蚌属的Pyganodon grandis、小方蚌亚科的Venustaconcha ellipsiformis及小方形蚌属的Quadrula quadrula三者雄性聚为一支,雌性聚为一支。因此,雌雄池蝶蚌线粒体存在一定的差异性,但其差异要比其他具有双单性遗传现象的淡水双壳类小得多,且池蝶蚌线粒体遗传可能不存在双单性遗传现象。     

池蝶蚌Sox2 基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox 基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用, 为研究池蝶蚌中Sox 基因的功能, 以人SRY基因HMG-box 保守区的序列设计简并引物, 以雌、雄池蝶蚌基因组DNA 和精巢cDNA 为模板进行扩增, 获得了2 个不完全相同的序列, 分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2 和cDNA-HMG, 长度均为220 bp, 编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3 及Sox14 有很高的同源性, 雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR 扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2 部分cDNA 片段, 长度为1774 bp, 该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2 的同源性最高; 在部分开放阅读框249 个氨基酸残基中, 具有Sox 家族典型的HMG-box 结构域, 与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2 的HMG-box 同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR 方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8 种组织hs-Sox2的表达情况, 结果显示, hs-Sox2 基因在8 种组织中均有表达, 其中在肾脏中的表达量最高, 其次是肠与闭壳肌, 在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺, 在肝脏中的表达量最低; 为了解hs-Sox2 在不同性腺发育时期的表达情况, 采用实时荧光定量PCR 方法分析了5 个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2 的表达情况, 结果显示在39 月龄性腺的表达量最高, 其次是16 月龄性腺, 63 月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明, hs-Sox2 基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。       

鄱阳湖区泥鳅遗传多样性研究

采用同工酶电泳、RAPD引物PCR扩增和线粒体DNA细胞色素b基因全序列3种方法,对鄱阳湖3种斑纹泥鳅的遗传结构进行分析。同工酶电泳显示3种斑纹泥鳅在LDH、MDH和EST这3种同工酶之间存在群体和组织差异;RAPD试验结果显示6条RAPD引物在18尾鄱阳湖泥鳅个体中共扩增出了169条不同分子量的RAPD标记,其中多态性带101条,多态性带的比例为59.56%,平均每个引物产生9.39条带和5.61条多态性带,不同斑纹泥鳅的遗传多样性指数显示3种斑纹泥鳅的遗传水平处于较高水平。以特异性引物进行PCR扩增,获得了1140bp的细胞色素b基因全序列。结果显示,3种不同斑纹泥鳅中检测出了1个共有单倍型和3个特有单倍型。与共有单倍型相比,大花斑泥鳅特有单倍型有91个变异位点,而小花斑泥鳅与无花斑泥鳅特有单倍型的变异位点为20和24个。基于单倍型构建的NJ树和MP树,显示大花斑泥鳅的特有单倍型EU145023处于独立的分支上,这反映出鄱阳湖地区不同斑纹的泥鳅之间在线粒体DNACytb基因中出现了一定距离的分化。       

嗜水气单胞菌诱导的池蝶蚌血细胞cDNA 文库的构建和亲环蛋白基因序列的初步分析

实验利用灭活的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导处于四龄池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)14h,将诱导后的池蝶蚌血细胞的总RNA 进行逆转录, 用LD-PCR 法合成双链cDNA, 从而首次成功构建池蝶蚌血细胞的全长cDNA 文库。原始文库的滴度为4106 cfu/cm3, 重组率为90%, 扩增后文库的滴度为3.55109pfu/mL。目前文库已随机测序672 个样品, 将所得双向序列进行拼接, 去除载体, 并多序列比对去除重复序列后, 发现436 条为已知功能序列, 其余为未知功能序列。序列中最小长度270 bp, 最大长度为2153 bp, 平均大小608.6 bp, 表明插入片段大小理想。从文库中筛选获得免疫相关基因池蝶蚌亲环蛋白A(HsCyp A)全长基因并进行序列分析。结果显示, HsCyp A 全长1229 bp, 序列包括52 bp 的5非编码区、495 bp 的开放阅读框、682 bp 的3非编码区和29 bp 的poly(A)尾, 没有明显的加尾信号。对Cyp A 氨基酸序列二级结构进行了较详细的分析并进行了三维建模, 同时构建了其系统进化树, 分析表明亲环蛋白家族是一个在进化上非常保守的蛋白家族。综合分析, Cyp A 在水生动物中不仅仅只是一种组成型蛋白, 而是可能在病原感染防御中发挥重要作用。       

天然三倍体鲫鱼突变体萍乡肉红鲫线粒体细胞色素b基因序列分析

用细胞色素b(Cyt b)基因特异性引物,对萍乡肉红鲫(Carassius auratus var.pingxiangnensis)的线粒体Cyl b基因进行PCR扩增和双向测序.在12个个体中均得到序列一致的Cyt b基因全序列,长度为1 140 bp.其A、T、G、C含量分别为28.2%(321)、28.8%(328)、14.8%(170)和28.2%(321),A+T含量(57%)明显高于G+C含量(43%).与其他水生动物相同基因片段碱基含量相似.该基因中密码子第1位核苷酸中4种碱基组成较为均衡;第2位核苷酸中T的使用率较高,为41.8%,G的使用率较低,为13.2%;密码子第3位A的使用率较高,为39.7%,而G的使用率较低,仅为6.3%.BLAST结果显示,萍乡肉红鲫与其他鲫鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性,其中与银鲫(C.a.gibelio)的相似性为93%,与普通鲫鱼(C.carassius)的相似性为98%.邻接法构建的分子系统进化树表明,萍乡肉红鲫与普通鲫鱼亲缘关系最近.