植物V类几丁酶苦瓜同源基因（McChi5）的克隆及特征分析

苦瓜是一种病害很少的蔬菜作物,用3′RACE方法从苦瓜叶片RNA中扩增了一个与烟草V类几丁酶序列相似的片段,进一步用Y－RACE方法扩增了相应的5′端序列,经序列拼接,获得了植物V类几丁酶苦瓜同源基因（McChi5)的全长cDNA基因,该基因全长1348bp,含有一个1044bp的ORF。推测的蛋白质由347个氨基酸组成,计算所得的分子量为38．3kD,等电点为5．77,同源性分析表明,McChi5蛋白与烟草V类几丁酶,拟南芥的推测几丁酶和类几丁酶蛋白,以及哺乳动物和细菌的一些几丁酶有序列相似性,并具有第18家族糖基水解酶的保守域,Southern blotting表明,在苦瓜基因组中存在2个拷贝的McChi5基因,同时也存在少数同源基因,RNA dot blotting分析表明,McChi5基因有组成性表达的特性,伤害处理对其表达的影响不明显,对McChi5基因可能的生物功能和应用作了进一步的讨论。     

棉花类LRR抗病蛋白(GhLRR-RL)基因的克隆及表达分析

从棉花胚株的cDNA－AFLP片段中,选取一个与拟南芥类LRR抗病原因（LRR－RL）序列相似的片段,用RACE方法延伸其3′和5′未知序列,得到一个棉花类LRR抗病蛋白的全长cDNA序列（GenBank登录号：AY040532）。该cDNA长1259bp,包含一个987bp的开放阅读框,具有Poly（A）加尾信号。推测蛋白质包含329个氨基酸,其中大部分是LRR区,其序列符合膜外LRR的共有序列LXXLXXLXXLXLXXNXGXIPXX。序列和结构比例分析表明：该棉花LRR－RL蛋白与拟南芥的两个类LRR抗病蛋白高度同源,而与植物的其他LRR蛋白结构不同,推测LRR－RL蛋白属于一类新的LRR蛋白。斑点杂交和3′RACE扩增表明,棉花LRR－RL基因具有组成性表达的特点。     

金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及其表达特性分析

根据中性海藻糖酶NTL基因的同源序列设计引物,PCR扩增出杀蝗专一菌株———金龟子绿僵菌CQMa102NTL基因片段,利用5′_RACE和3′_RACE扩增出NTLcDNA的5′和3′端序列,经拼接得到CQMa102NTL基因cDNA全长。根据其全长cDNA序列,设计引物PCR扩增出CQMa102NTL的完整基因。为了解该基因的上游调控信息,采用PanhandlePolymeraseChainReactionAmplification方法扩增其上游序列。序列分析表明,CQMa102NTL全长DNA3484bp,cDNA全长2385bp,编码737个氨基酸的蛋白,推测蛋白分子量为83.1kD;含有3个内含子,包含一个依赖于cAMP的磷酸化作用位点(RRGS)和一个钙附着位点(DTDGNMQITIED);上游序列含有一个压力反应元件(CCCCT);与金龟子绿僵菌广谱性菌株ME1NTL的核苷酸序列和氨基酸序列分别具有93%和99%同源性,由此确定该序列为金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因序列。Southern杂交表明,NTL基因在CQMa102基因组中为单拷贝。Northern杂交表明,NTL基因转录出约2.5kb的mRNA单带,在液体培养条件下,对数生长前期表达水平最高,对数生长后期降到最低,进入稳定生长期后表达水平又有所提高。金龟子绿僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因DNA全长和cDNA全长登录GenBank,登录号分别为:AY557613,AY557612。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

一个新高产青蒿倍半萜合酶基因的克隆、表达和分析

用RACE方法从青蒿(Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个新的1 886 bp的全长倍半萜合酶cDNA.克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶、莨菪岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为39%、38%和41%;与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50%、48%和59%.cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在.Northern blotting分析表明此基因在茎、叶和花中表达,在根中没有表达.     

鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特的关键作用,因而也称为微囊藻毒素去毒酶.从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列.序列分析结果表明,鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920bp,其中5′-UTR长74bp,3′-UTR长174bp,编码区长672bp,编码223个氨基酸.应用基因组步行法,在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878bp序列.与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同,鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区,发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE),表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.     

鲢鱼可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)基因cDNA全序列与5′调控区的克隆与分析

淡水鱼类可溶性谷胱甘肽S-转移酶(sGST)在微囊藻毒素去毒代谢过程中具有独特 的关键作用,因而也称为微囊藻毒素去毒酶. 从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)肝脏通过简并引物克隆微囊藻毒素去毒酶基因cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全序列. 序列分析结果表明,鲢鱼肝脏微囊藻毒素去毒酶基因cDNA全长920 bp,其中5′-UTR长74 bp,3′-UTR长174 bp,编码区长672 bp,编码223个氨基酸. 应用基因组步行法,在鲢鱼克隆得到淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因5′侧翼区878 bp序列. 与哺乳动物及海水鱼sGST基因不同,鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因的5′侧翼区,发现存在多个脂多糖反应元件(LPSRE),表明来源于毒藻的脂多糖可能对鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因表达有潜在调控作用.     

早熟油菜成花相关基因LFY的克隆与分析

以甘蓝型油菜晚熟品种RG-8的早熟突变体RG-8M为材料,通过同源克隆法得到1个LEAFY(LFY)同源基因,命名为BnLFY。该基因cDNA全长为1 310bp,包含1个长为1 248bp的开放阅读框,编码415个氨基酸。序列分析表明,推测的氨基酸序列含双子叶植物LFY类蛋白特有的N端脯氨酸富集区、中央酸性区、亮氨酸拉链结构以及富含赖氨酸与精氨酸的碱性区;且与几种十字花科植物LFY类蛋白的氨基酸序列一致性均在84%以上。转录表达分析表明,BnLFY基因在油菜中为组成型表达。     

一个新高产青蒿倍半萜合酶基因的克隆、表达和分析

用RACE方法从青蒿（Artemisia annua L.)高产株系001中克隆了一个新的1886bp的全长倍半萜合酶cDNA。克隆的倍半萜合酶氨基酸序列与烟草马兜铃烯合酶,莨菪岩兰螺旋二烯合酶,棉花杜松烯合酶的一致性分别为39％,38％和41％;与青蒿柏木脑合酶,紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合酶克隆cASC125的一致性为50％,48％和59％。cDNA编码区序列被克隆进原核表达载体pET-30a,并在大肠杆菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达,但过量表达的蛋白主要是以不溶性蛋白形式存在。Northern blotting分析表明此基因在茎,叶,花中表达,在根中没有表达。     

无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)RksAGL基因克隆及表达分析

以无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)花芽提取的RNA为模板,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到无籽刺梨AGL基因的c DNA全长,命名为Rks AGL。序列分析表明,c DNA全长1 089 bp,开放阅读框长度为747 bp,可编码248个氨基酸。编码蛋白分子质量预测为28.56 k D,等电点为9.40,无信号肽序列。分析表明,Rks AGL基因属于MADS-box基因家族C类基因,其编码的蛋白与其它植物AGAMOUS类蛋白具有较高的同源性。实时定量PCR分析表明,RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达,在萼片和花瓣中不表达     

普通烟草K^＋通道基因NKT4的克隆、序列和表达分析

通过比对拟南芥、胡萝卜、番茄和马铃薯的K+通道氨基酸序列得到了保守序列,设计1对简并引物,利用RT-PCR获得3条490bp的普通烟草K+通道基因中间片段.以其中一条中间片段设计特异性引物,应用RACE方法得到5′末端和3′末端cDNA序列.通过拼接并结合全长克隆及测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT4(GenBank登录号为FJ233071).NKT4的cDNA全长为2937bp,其中5′非编码区45bp、编码区2679bp、3′非编码区213bp;编码区编码892个AA.构建了一个烟草、拟南芥及相关植物K+通道蛋白的系统进化树.基因表达分析表明,NKT4主要在烟草主根和侧根中表达,在烟草叶中也有少量表达.     

中国桔梗PgF3′5′H基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR结合RACE技术,从中国桔梗(Platycodon grandiflorus)花朵中分离克隆了1个类黄酮-3′,5′-羟基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)基因的全长cDNA序列,命名为PgF3′5′H(GenBank登录号JQ403611)。PgF3′5′H基因全长1 787bp,包含1个编码532个氨基酸长为1 599bp的开放阅读框。蛋白序列比对显示,PgF3′5′H基因蛋白与其他物种的F3′5′H蛋白有很高的相似性,包含有CYP基序、Ⅰ螺旋区和血红素结合区等保守性序列,以及一段类似于风铃草F3′5′H蛋白的9个氨基酸的特殊区。半定量RT-PCR结果显示,PgF3′5′H的表达量随着花朵发育和花色素的出现而呈递增趋势,在花发育第四阶段的蓝色花蕾中达到最高,而在叶中不表达。研究推测,PgF3′5′H基因可能在中国桔梗蓝色花色素的生化合成途径中起重要作用。     

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSBl细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA(chicken telomerase RNA,chTR)全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列.序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465 bp,其中模板区的11个核苷(5'-CUAACCCUAAU-3')合成端粒亚单位(TTAGGG)n.chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础.     

新疆盐穗木GRAS转录因子基因克隆及表达分析

利用抑制消减杂交法从藜科盐穗木属盐生植物盐穗木中分离得到了一个盐胁迫响应的表达序列标签(EST)片段,结合SMARTTMRACE技术获得了盐穗木GRAS转录因子基因的cDNA。序列分析表明,该基因全长2 090bp,含有1 635bp的阅读框,294bp的5′-UTR和161bp的3′-UTR,编码544个氨基酸,分子质量为61.503kD,理论等电点为6.1。系统进化树和Blast同源序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GRAS家族特有的C端保守结构域,并与葡萄GRAS家族蛋白VvSCL13聚集在一起,故将该基因命名为HcSCL13(GenBank登录号KC68640)。实时荧光定量qRT-PCR分析表明,HcSCL13基因在盐胁迫后表达呈明显上调,初步推测Hc-SCL13基因可能与盐穗木的耐盐性相关。     

''黄金桃''PpAG基因克隆及其相似片段序列分析

以桃品种黄金桃为材料,通过同源克隆法获得了AGAMOUS基因的同源基因,命名为PpAG.序列分析表明:该基因全长为6 372 bp,含有8个外显子,大小为42~231 bp;7个内含子,大小为88~3 889 bp.Southern杂交结果表明,该基因在桃基因组中为单拷贝.此外,还获得了与PpAG基因5′端序列近似的一段序列,但该序列缺失了PpAG基因表达的关键序列.推测在桃基因组中PpAG基因只存在单拷贝,但可能存在着不能正常表达的基因或基因片段,从而影响雌蕊与雄蕊的形成和发育.     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

细粒棘球蚴eg95基因的克隆以及原核融合表达

从青海省羊源细粒棘球蚴提取基因组DNA,PCR扩增eg95基因并且克隆。测序结果表明该基因序列全长1262bp,由2个内含子和3个外显子组成,3个外显子分别为70bp、306bp和95bp。因此,推测其ORF为471bp,编码156个氨基酸。用RT—PCK方法扩增该基因的ORF,经克隆、DNAstar比对分析序列,它与预测的ORF序列100％相同。将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1,构建重组表达质粒pGEX-5x-1-eg95,将其转入表达菌株BL21中进行原核表达。表达产物经过SDS—PAGE电泳分析,得到一条特异的蛋白条带;质谱鉴定证明表达的蛋白确实是eg95抗原蛋白;酶联接免疫吸附剂测定表明抗原抗体发生了特异性反应,进一步证明融合蛋白进行了正确表达,从而为囊型包虫病的研究奠定基础。     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

异色瓢虫过氧化氢酶(Catalase)的基因克隆及序列分析

【目的】克隆异色瓢虫Harmonia axyridis保护酶系中过氧化氢酶(Catalase,CAT)的全长cDNA序列,并分析该基因的基本特性。【方法】采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫中克隆到HaraxCAT基因的cDNA全序列(GenBank登录号KC991026),并采用生物信息学的相关方法进行了分析。【结果】HaraxCAT的cDNA序列全长1 781 bp,其包含110 bp的3′非编码区域和45 bp的5′非编码区域,可读框长1 626 bp,编码541个氨基酸。预测该基因编码蛋白的分子量为61.55 ku,理论等电点为8.33,包含3个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。并且该基因包含了一个长达18个氨基酸的潜在的活性位点序列FDRERIPERVVHAKGAGA和血红素配体信号序列RIFSYGDTH。同源比对不同昆虫的CAT蛋白序列,发现昆虫CAT非常保守,HaraxCAT与其他昆虫的同源性高达65%及以上,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,达75.25%;系统发育分析表明其与鞘翅目赤拟谷盗和白星金花龟Protaetia brevitarsis亲缘关系最近。【结论】获得异色瓢虫catalase基因的cDNA全长序列,证实昆虫CAT蛋白非常保守。