半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶(P450aromB)在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型P450arom的同源性较高(48.3%-66.1%),与性腺型P450arom的同源性较低(34.2%-49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性

以赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara)脑垂体中提取的RNA为模板 ,根据芳香化酶的保守序列设计引物 ,利用GeneRacerTM 技术 ,克隆出两种芳香化酶即脑芳香化酶 (P4 5 0aromB)和性腺芳香化酶 (P4 5 0aromA)的cDNA ,其全长分别为 190 1bp (编码 5 0 9aa)和 1833bp (编码 5 18aa)。序列分析结果表明 ,赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA序列的同源性为 5 1 6 % ,氨基酸序列之间同源性为 6 2 5 % ,与斜带石斑鱼两种芳香化酶氨基酸同源性分别为 94 7%和 97 9%。对 8个科的 10种鱼进行了分子系统进化树分析 ,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。以特异性引物扩增雌、雄赤点石斑鱼各种组织 (垂体、嗅球、端脑、下丘脑、中脑、后脑、延脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、性腺、鳃、胃、肠、皮肤、脂肪、肌肉、头肾、胸腺、鳔 ) ,以β actin作内标比较各组织芳香化酶基因表达量的差异 ,结果表明 ,赤点石斑鱼脑芳香化酶 (P4 5 0aromB)有广泛的组织分布 ,脑和垂体的表达量很高 ,各组织表达量有明显的雌、雄差异 ;而性腺芳香化酶 (P4 5 0aromA)表达主要集中于垂体和性腺 ,且不论雌雄 ,其性腺表达量均高于脑垂体 ,和P4 5 0aromB的表达模式明显不同 ,表现为在脑部 ,P4 5 0aromB表达量高于P4 5 0aromA ,而在性腺 ,     

稀有鮈鲫脑芳香化酶cDNA片段的克隆与表达分析

芳香化酶（P450arom）是雌激素合成过程中的关键酶,在性别分化中起重要作用。鱼类存在卵巢性和脑型两种芳香化酶,分别由Cyp19a和Cyp19b编码。稀有鮈鲫作为我国特有的实验动物,尚无其芳香化酶的有关资料,其性别分化机制亦不清楚。本研究采用RT-PCR的方法以简并引物扩增了稀有鮈鲫脑型芳香化酶基因Cyp19b的部分序列,其长度为1070 bp, 编码357个氨基酸残基,具有典型的芳香化酶结构域。RT-PCR分析发现该基因主要在稀有鮈鲫的脑中表达,在性腺、肠、肾中也有表达;其在雌、雄脑中的表达差异不显著。在胚胎发育阶段,Cyp19b的表达从囊胚期开始,至神经胚期达到较高水平,随后下降,孵化期又有所增强,孵化10天后维持在高水平。这些结果说明Cyp19b以脑中表达为主,可能在稀有鮈鲫神经系统发育和脑的性别分化中有重要作用。     

黄鳝P-450芳香化酶基因的克隆及序列分析

P-450芳香化酶(P450arom)是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文采用RT-PCR和RACE(Rapid amplifi- cation of cDNA ends)法,首次分离和克隆了雌雄同体鱼黄鳝卵巢中P450 arom基因。该基因cDNA全长1802bp(不包 括poly(A)),5'端非翻译区有49bp,3'端202bp(不包含poly(A)),阅读框(Open reading frame,ORF)1551bp,翻译成517 个氨基酸,计算的蛋白质分子量58．2kDa。同源性分析显示,黄鳝卵巢P450arom的氨基酸序列与其他鱼卵巢 P450arom具有63％-80％同源性,与其他鱼脑P450arom为58％-60％同源,与人胚盘和鸡卵巢P450arom则为 50％-52％同源;但在芳香化酶高保守区(包括1-螺旋区,芳香化酶特异保守区和血红素结合区)的同源性高达 76％-92％。系统发育分析表明芳香化酶基因是单起源,黄鳝卵巢芳香化酶基因与鳉鱼卵巢的关系最近,与鱼类卵 巢P450arom属于同一分支的,与鱼类脑及鸡和人的属于不同分支。     

四川裂腹鱼脑型芳香化酶Cyp19b基因组织分布及温度对其表达水平的影响

为研究脑型芳香化酶基因Cyp19b在四川裂腹鱼(Schizothorax kozlovi)早期性别分化中的作用,采用RACE方法从四川裂腹鱼脑中扩增得到该基因c DNA全长序列,并应用荧光定量RT-PCR技术测定该基因m RNA的相对表达量,探讨该基因在不同规格四川裂腹鱼鳃、脑、心、肝、脾、肾、肌肉、精巢、卵巢组织中的表达差异,以及温度对其早期仔鱼阶段该基因表达的影响。四川裂腹鱼Cyp19b基因的c DNA全长序列共3 021 bp,共编码507个氨基酸,属于脑型芳香化酶基因;四川裂腹鱼Cyp19b基因编码的氨基酸序列与其他鱼类脑型芳香化酶基因编码的氨基酸序列同源性可达70%以上,而与性腺型芳香化酶基因编码的氨基酸序列同源性较低,为64%左右;四川裂腹鱼Cyp19b基因仅在脑组织中表达,具有比较高的组织特异性,且随着个体的增长,逐渐呈现显著的雌雄差异;对不同温度处理12日龄仔鱼6 d后,低温(10℃和14℃)能显著促进Cyp19b基因表达量的升高,但高温(26℃)却对其表达量无显著影响。由此推测,脑型芳香化酶基因Cyp19b可能在低温导致四川裂腹鱼雌性化过程中发挥着重要作用。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫相关酶活力和低氧应激后HIF-1表达的影响

为探讨饲料中谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫以及低氧应激后HIF-1表达的影响, 实验共设计了4种谷氨酰胺添加量分别为0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微颗粒饲料(游离谷氨酰胺测定值分别为0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%), 饲喂35日龄半滑舌鳎稚鱼[平均干重(10.640.86) mg]。每天饱食投喂5次,养殖周期30d, 养殖结束后进行低氧应激实验。研究结果表明, 谷氨酰胺添加量为0.5%时半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶(LZM)活力显著高于未添加组(P0.05)。饲料中不同谷氨酰胺水平对鱼体总一氧化氮合酶(TNOS)活力和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力没有显著影响(P0.05)。实验克隆了半滑舌鳎低氧应激关键基因缺氧诱导因子1 (HIF-1), 得到749 bp半滑舌鳎HIF-1核心序列, 系统进化树分析表明半滑舌鳎HIF-1氨基酸序列与大部分鱼类具有较高同源性。定量PCR结果显示, 饲料中谷氨酰胺水平对低氧应激后半滑舌鳎稚鱼内脏团HIF-1表达量未产生显著影响(P0.05)。综上所述, 在饲料中添加谷氨酰胺能够显著增强半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶活力(P0.05), 提高非特异性免疫水平。     

翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的克隆及表达研究

采用同源克隆与SMART RACE技术首次分离和克隆了翘嘴鳜性腺型芳香化酶基因CYP19a的c DNA全长,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)技术分析了其在翘嘴鳜成体不同组织及性腺不同发育时期的表达特点。序列分析结果显示,CYP19a基因全长1 873 bp(Gen Bank登录号为KX911988),其中开放阅读框长1 581 bp,编码526个氨基酸。通过多序列比对,发现该基因编码的蛋白质具有P450arom A特定的功能保守序列,包括I-螺旋区、Ozol肽区、亚铁血红素结合区域以及芳香化酶特异性结合区域;同时,CYP19a基因序列的同源性分析结果显示,其在脊椎动物中较为保守。此外,q PCR检测结果显示,CYP19a基因在翘嘴鳜成体组织中的表达存在显著差异(P0.05),主要在性腺中表达,其次在脑和肝脏有少量表达;而且CYP19a基因在繁殖期性腺中的表达量显著低于非繁殖期性腺中的表达量(P0.05)。以上研究表明,CYP19a基因在鱼类性腺形成及发育过程中具有重要作用。     

赤点石斑鱼卵型芳香化酶基因启动子调控绿色荧光蛋白在斑马鱼早期生殖腺中的表达

P450芳香化酶(P450arom)是生物体内合成雌激素的关键酶。为研究赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)卵型芳香化酶基因(EaCyp19a1a)启动子的调控作用,构建了EaCyp19a1a启动子9个不同的5′端缺失片段与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)组成的表达载体,分别命名为pEaCyp19a1a-EGFP1-9。在COS-7细胞中的瞬时转染实验证明载体pEaCyp19a1a-EGFP7具有很强的转录活性。通过显微注射,将线性化的pEaCyp19a1a-EGFP7载体注入斑马鱼单细胞期受精卵中,定期在荧光显微镜下观察GFP的表达。结果发现GFP在胚胎期(受精后约48h)开始表达,主要发生在斑马鱼早期生殖腺细胞中,具有明显的性腺特异性。这说明EaCyp19a1a的启动子序列中含有调控其性腺特异表达的顺势作用原件。研究为进一步探明芳香化酶在鱼类性别分化和性别转变过程中的作用奠定了基础。     

黄鳝性逆转过程中Gsdf基因cDNA片段的克隆和表达分析

通过RT-PCR法从黄鳝性腺中首次克隆获得黄鳝Gsdf(gonadal soma-derived factor)基因的片段序列,该片段序列长218 bp,编码72个氨基酸。氨基酸序列分析表明黄鳝Gsdf基因片段与其他物种的相似性在61%~76%之间,其中与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)GsdfⅠ型、舌齿鲈GsdfⅡ型同源性最高,均为76%;系统进化树显示,黄鳝Gsdf与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Gsdf基因聚成一支,与鲈形目鱼类亲缘关系较近。此外,不同性腺组织的基因检测结果显示,黄鳝Gsdf在卵巢和间期性腺的表达量很低,两者没有显著性差异(P0.05);在精巢组织中的表达量显著高于卵巢、间期性腺组织的表达量(P0.05)。上述结果表明Gsdf基因可能在黄鳝的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

高雄激素对大鼠胎盘P450芳香化酶表达的影响

目的:探讨孕晚期高雄激素环境对大鼠胎盘绒毛P450芳香化酶(cytochrome P450 aromatase,P450arom)表达的影响.方法:于妊娠15～20d实验组大鼠给予丙酸睾丸酮0.6mg颈部皮下注射,对照组给予中性茶油0.6mg颈部皮下注射.于妊娠21d处死大鼠留取胎盘,应用半定量逆转录-聚合酶键反应(RT-PCR)检测实验组与对照组P450aroma mRNA的表达;采用免疫组化(PV-6002)二步法测定P450aroma的蛋白表达.结果:RT-PCR法测实验组与对照组mRNA相对表达量分别为0.294±0.251和0.077±0.056,有显著性差异(P＜0.05).免疫组化法测得实验组P450aroma蛋白表迭高于对照组,P<0.05.结论:大鼠孕晚期暴露于高雄激素环境可以诱导胎盘绒毛P450芳香化酶在转录和翻译水平表达增强.     

雄烯二酮对赤点石斑鱼内分泌及性腺发育的影响

采用腹部埋植法,应用连续组织切片技术、放射免疫测定方法和半定量RT-PCR技术,检测了间隔30d3次埋植不同剂量（高剂量H：100μg／g体重,低剂量L：10μg／g体重）的雄烯二酮（4-androstene-3,17-dine,ADSD）诱导2龄赤点石斑鱼性腺发育过程中血清性类固醇激素含量、芳香化酶表达和活性的变化。结果显示：第1次埋植ADSD后30d即可诱导雌性赤点石斑鱼发生不同程度的性逆转,性腺成熟指数明显下降,性腺中卵细胞退化,精原细胞增殖,出现大量精母细胞和精子细胞,第1次埋植ADSD后30d经轻微挤压腹部有10％（低剂量组）和15％（高剂量组）的鱼可排精;第2次埋植后30d明显提高性逆转效果,排精率分别达到80％和86．7％,性逆转雄鱼的精巢在组织结构上与正常雄鱼精巢一样,精子活力与正常雄鱼相同,对照组鱼卵巢发育良好;第3次埋植后30d排精率分别为90％和80％,埋植ADSD后性腺芳香化酶（P450aromA）表达和活性显著降低,脑芳香化酶（P450aromB）表达显著升高,前脑芳香化酶活性显著升高,血清T,11-KT水平显著高于对照组,而血清E2水平先升高,然后逐渐降低。说明血清T,11-KT水平增加,性腺芳香化酶表达及活性降低在控制雌雄同体的赤点石斑鱼的性转化和精子发生中起重要作用。     

半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用

半滑舌鳎性别控制和全雌育种等研究领域中迫切需要一种能够快速鉴定鱼类个体遗传性别的有效方法。文章采用AFLP技术, 利用选择性引物组合(E-ACT/M-CAA)从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记。对该标记进行二次PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、克隆、测序。分析表明, 序列全长为791 bp, 与GenBank中的序列无同源性。以该雌性特异AFLP标记DNA序列为模板, 设计了一对特异的PCR引物, 成功地将其转化为SCAR(Sequence characterized amplified regions)标记, 并在100尾已知性别的半滑舌鳎个体(雌雄各50尾)中进行验证, 结果表明, 该SCAR标记在所有雌性个体中均扩增得到一条长度为324 bp的DNA条带, 而在49尾雄性个体中均扩增不到该DNA条带(有1尾雄性个体例外), 证明该SCAR标记是雌性特异的, 并可用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。随后, 利用该SCAR标记检测了3日龄半滑舌鳎幼苗, 结果表明, 雌性个体比例为41.7%。     

半滑舌鳎血红蛋白α1的基因克隆及其在短期低氧胁迫下的表达分析

该文克隆了海洋鱼类——半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis,Cs)的血红蛋白α1 (CsHb-α1)基因全长cDNA序列,并研究了其在短期低氧胁迫下的表达变化.CsHb-α1 cDNA全长594 bp,编码144个氨基酸.氨基酸序列分析表明,该基因与其他物种的Hb具有较高的序列相似性.实时定量PCR检测显示CsHB-α1在心、肝、脾脏、肾脏和血液中表达量较高.与对照组相比(溶解氧:6.2 mg/L),在短期(5～120 min)及36 h低氧胁迫(溶解氧:1.0 mg/L)后,CsHb-α1在心、肝脏、脾脏、肾脏、血液和腮腺中表达量明显升高.这表明Hb-α1的上调是半滑舌鳎适应低氧胁迫的一个重要分子组成.     

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织（肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢）中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织（肝脏、肠、脾脏和头肾）中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、葡聚糖（WGP）、聚肌胞苷酸（poly I:C）4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。     

两种泥鳅芳香化酶基因的克隆与时空表达

鱼类的性别分化易受发育环境的影响。向性成熟的泥鳅和大鳞副泥鳅个体注射绒毛膜促性腺激素,获得卵子和精子进行人工授精。把胚胎分别置于20℃、25℃和30℃条件下,使其发育。经性腺检查发现随着温度的升高两种泥鳅中雄性个体所占的比例明显升高,获得明显的偏雄比率群体。根据已知细胞色素P450芳香化酶CYP19 b基因序列设计嵌套简并引物用巢式PCR扩增并克隆出了两种泥鳅的CYP19 b的DNA片段。MaCYP19 b片段和Pd-CYP19 b片段分别长1337bp和1473bp。在此基础上用各自的特异引物克隆出两种泥鳅CYP19 b的相应cDNA片段。通过基因组DNA和cDNA序列的比较证明两种泥鳅的CYP19 b基因均包含三个内含子和四个外显子,编码的蛋白质序列长145氨基酸残基。以GAPDH基因为对照,分别对两种泥鳅成体组织和不同发育阶段的胚胎的CYP19 b进行了半定量RT-PCR表达分析,结果表明泥鳅CYP19 b基因只在成体泥鳅卵巢、肾以及原肠胚和神经胚中表达。大鳞副泥鳅CYP19 b基因在成体的脑、卵巢和肾以及神经胚和卵黄吸收期表达。这些结果为揭示细胞色素P450芳香化酶基因与环境性别决定机制的关系奠定了基础。       

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。