半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫相关酶活力和低氧应激后HIF-1表达的影响

为探讨饲料中谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫以及低氧应激后HIF-1表达的影响, 实验共设计了4种谷氨酰胺添加量分别为0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微颗粒饲料(游离谷氨酰胺测定值分别为0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%), 饲喂35日龄半滑舌鳎稚鱼[平均干重(10.640.86) mg]。每天饱食投喂5次,养殖周期30d, 养殖结束后进行低氧应激实验。研究结果表明, 谷氨酰胺添加量为0.5%时半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶(LZM)活力显著高于未添加组(P0.05)。饲料中不同谷氨酰胺水平对鱼体总一氧化氮合酶(TNOS)活力和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力没有显著影响(P0.05)。实验克隆了半滑舌鳎低氧应激关键基因缺氧诱导因子1 (HIF-1), 得到749 bp半滑舌鳎HIF-1核心序列, 系统进化树分析表明半滑舌鳎HIF-1氨基酸序列与大部分鱼类具有较高同源性。定量PCR结果显示, 饲料中谷氨酰胺水平对低氧应激后半滑舌鳎稚鱼内脏团HIF-1表达量未产生显著影响(P0.05)。综上所述, 在饲料中添加谷氨酰胺能够显著增强半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶活力(P0.05), 提高非特异性免疫水平。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶(P450aromB)在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型P450arom的同源性较高(48.3%-66.1%),与性腺型P450arom的同源性较低(34.2%-49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶（P450aromB）在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184 bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型Ｐ450arom的同源性较高（48.3%—66.1%）,与性腺型Ｐ450arom的同源性较低(34.2%—49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1％。RT-PCR分析表明：P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD8基因的克隆与诱导表达

探讨红笛鲷(Lutjanus sanguineus)CD8基因的基本特性。应用同源克隆和cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了红笛鲷CD8α和CD8β基因,并分析了其在不同组织的表达分布及免疫刺激物诱导后的表达模式。结果显示,CD8αcDNA序列全长1 576 bp,编码225个氨基酸。红笛鲷CD8β基因cDNA序列全长为1 486 bp,编码210个氨基酸。氨基酸序列分析结果显示,CD8α和CD8β均由信号肽、免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily,Ig SF)可变区、铰链区、跨膜区和胞浆区组成。荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,q RT-PCR)分析显示红笛鲷CD8α和CD8β基因在胸腺表达量最高,其次为中肾、鳃、肠、皮肤、脾和头肾。红笛鲷头肾淋巴细胞体外经LPS、ConA和PolyI:C刺激8 h后CD8α和CD8β表达量显著上调(P0.01)。哈维氏弧菌疫苗刺激24 h后鳃、头肾、脾脏、和肠的表达量上升。     

猪CuZnSOD基因的克隆、表达及功能分析

为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用RACE(Rapid amplification of cDNA end)方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA进行克隆测序,分析其结构和功能,并用Real-timePCR检测CuZnSOD基因的表达.结果表明,CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号:GU944822),包含76 bp的5'UTR和120 bp的3'UTR序列.全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点为6.03.CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点.二级结构中α螺旋仅占1.31%.在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和褐鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%.CuZnSOD存在典型的金属结合配体结构域(GFHVHQFGDNT).基于蛋白序列所构建的分子进化树表明猪与牛的亲缘关系最近.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓,肌肉、背膘和胃中都能检测到,其在肾脏,小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低.     

川草 2 号老芒麦 (Elymus sibiricus L.) atpA 基因的克隆及其调控表达

ATPase 与植物的耐寒性密切相关 . 运用 mRNA 差异显示技术 (DDRT-PCR) 从耐寒植物川草 2 号老芒麦 (Elymus sibiricus L. cv. ‘ chuancao No.2 ' ) 中获得了受冷抑制的 atpA 基因表达序列标签 (EST) 序列,通过 5 ′ cDNA 末端快速扩增 (RACE) 获得了 atpA 基因全长 cDNA 为 1 754 bp ,开放阅读框 (ORF) 长 1 518 bp ,编码 505 个氨基酸 . 氨基酸序列与小麦、水稻、玉米 atpA 基因分别具有 95 ％、 94 ％、 94 ％的相似性 . 对 2 ℃低温胁迫及解除胁迫后恢复过程中共 13 个时段的 RNA 印迹分析表明, atpA 基因在低温胁迫 12 h 转录受到强烈抑制,在低温胁迫开始后的 4 ～ 8 h 及解除胁迫后的 16 ～ 24 h ,其转录水平明显强于对照 . 实验结果为揭示 CF₁α亚基对调控 ATPase 在植物御冷性反应的作用,以及α亚基在植物低温信号转导中的作用提供了新的线索 .     

日本白鲫IGF-1基因全长cDNA克隆及组织表达分析

通过已获得的多个物种IGF-1基因的cDNA序列,设计合成简并引物,用日本白鲫的肝脏总RNA反转录获得的cDNA做模板,克隆获得了IGF-1中间序列.在此基础上,通过SMART RACE,获得了IGF-1全长cDNA序列.经过序列对比分析,所得到的序列是日本白鲫(Carassius cuvieri)IGF-1 cDNA全长,其中开放阅读框为486 bp,编码含161个氨基酸的蛋白质,该蛋白质含有保守的信号肽、B、C、A、D和E结构域和6个半胱氨酸残基.同时,系统进化分析表明,在进化过程中IGF-1基因在鱼类中保持着高度保守的进化特征.IGF-1在日本白鲫中广泛表达于多个组织,尤其在肝脏中表达量最高.在垂体、心脏、肾脏和肌肉中有较高的表达.而在脑、脾脏、精巢和卵巢中的表达量较低.     

翘嘴鳜NADPH氧化酶三个调节亚基cDNA的克隆及表达特征

吞噬细胞NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS),在机体的防御体系中起着非常重要的作用。该文利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法,对翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi) NADPH氧化酶的3个调节亚基p40phox、p47phox和p67phox的cDNA进行了克隆。结果显示p40phox基因cDNA序列全长为1 406 nt,开放阅读框长度为1 050 nt,翻译成349个氨基酸;p47phox 基因cDNA序列全长为1 686 nt,开放阅读框为1 209 nt,翻译成402个氨基酸;p67phox基因cDNA序列全长为2 185 nt,开放阅读框长度为1 488 nt,翻译成495个氨基酸。半定量PCR分析显示在翘嘴鳜血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肾、肝、脾、胸腺组织中都能检测到这3个亚基的mRNA表达,然而,它们在不同组织中的表达强度具有差异。经柱状黄杆菌灭活苗FKG₄免疫后,p40phox亚基mRNA在翘嘴鳜血液和头肾中的表达量显著上升,p47phox在头肾和脾脏中的表达量显著上升,而p67phox在血液、头肾和脾脏中的表达量均显著上升。由此推断NADPH氧化酶参与了翘嘴鳜机体的抗菌免疫应答。     

多鳞fih-1基因克隆及其低氧胁迫的mRNA表达

为研究多鳞(Sillago sihama)低氧诱导因子抑制因子-1(factor inhibiting hypoxia inducible factor 1, fih-1)在低氧胁迫后的表达机制, 实验通过PCR扩增技术克隆出多鳞fih-1基因cDNA全长1280 bp, 开放阅读框(ORF)1065 bp, 编码353个氨基酸, 具有JmjC保守结构域。多序列比对与聚类分析显示, 多鳞与大黄鱼和尖吻鲈的亲缘关系最近, 与哺乳动物、两栖类和禽类的亲缘关系较远。fih-1基因mRNA在多鳞多个组织中有不同表达, 在精巢、卵巢和肌肉中的表达水平最高, 在鳃、心脏和肝脏组织表达水平较高, 在脑组织的表达水平较低。实时荧光定量PCR分析fih-1基因在低氧胁迫处理前后鳃和心脏组织中mRNA的表达情况, 结果显示fih-1基因在两个组织均随低氧胁迫处理时间延长表达量显著升高 (P< 0.05)。研究表明fih-1基因在多鳞低氧信号传导通路中扮演重要角色, 为开展并解释多鳞低氧胁迫遗传机制提供候选基因。     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因全长克隆及分析

根据已知的与盐胁迫相关的EST序列,采用SMART RACE方法克隆了紫花苜蓿果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ALD)全长cDNA,命名为MsALD(GenBank accession No.FJ896113).序列分析结果表明,该cDNA全长1 487 bp,包含一个1 194 bp的最大开放阅读框,编码398个氨基酸.经同源比对和进化树分析,MsALD基因编码的氨基酸与红三叶草、马铃薯、烟草等的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(ALD)氨基酸序列一致性高达90%以上,确定其属于第Ⅰ类果糖-1,6-二磷酸醛缩酶.半定量RT-PCR分析表明,MsALD基因可能与紫花苜蓿抗盐机理相关.     

黄颡鱼PGRP-L基因克隆及其对爱德华氏菌的反应

为了研究肽聚糖识别蛋白家族(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)先天免疫应答中发挥的作用, 根据NCBI中斑马鱼(Danio rerio) 和虹鳟(Oncorhynchus mykiss) PGRP-L的基因信息, 采用简并引物和RACE方法从黄颡鱼肝脏中克隆得到了一个长型PGRP (PfPGRP-L)基因. PfPGRP-L基因的全长cDNA序列大小为1617 bp, 其中5'和3'非翻译区的长度分别为135和72 bp, 开放阅读框为1410 bp, 编码469个氨基酸. 同源性和系统进化分析表明, 黄颡鱼PGRP-L与虹鳟的同源性为60%, 与脊椎动物的PGLYRP2 或PGRP-L聚在一起. 半定量RT-PCR分析发现PfPGRP-L基因在黄颡鱼鳃、胸腺、肝脏、脾脏、肠道、肾脏、头肾、心脏、血液和肌肉组织中均有分布, 但在肠道和脾脏中的表达量较为丰富, 而在肌肉和血液中表达则很少. 用爱德华氏菌刺激后, PfPGRP-L在肝脏、脾脏、肠道及头肾中的表达明显上调. 结果表明, PfPGRP-L在黄颡鱼抵抗病原菌中具有重要作用.     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达

根据柽柳cDNA文库中获得的eIF-5A基因片段,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.cDNA长度为799 bp,编码159个氨基酸.将该cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-eIF5A.不同浓度NaCl胁迫下大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(pET28a-eIF5A)比E.coli BL21(pET28a)有明显的抗盐性,前者菌株存活率在1.0 mo1·L-1NaCl盐胁迫下是后者的9.3倍,据此认为E.coliBL21(pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与eIF-5A基因的表达相关.该基因的GenBank登录号为AY587771(基因)、AAT01416(蛋白).     

大黄鱼CYP1A基因cDNA的克隆与表达分析

由于外源化合物能诱导鱼类CYPIA(P4501A)的表达,因而它广泛被用作评价水环境污染生物标记物.利用RT-PCR结合RACE技术从大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏克隆了CYP1A基因全长cDNA序列.经分析,该cDNA的5'末端有175 bp的非翻译区.开放阅读框为1 566 bp,编码521个氨基酸和一个终止密码子,3'末端有857 bp的非翻译区,3'非翻译区有一个多聚腺苷酸信号及两个与mRNA的快速降解有关的AUUUA序列.推测大黄鱼CYP1A的氨基酸序列和欧洲鲈鱼的相似度最高迭89.6%.用RT-PCR检测大黄鱼CYP1A的表达特征发现,在所检测的9个组织中均有表达,以肝脏、消化道、脾脏和肾脏的表达量较高.     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

星豹蛛两个GST基因克隆、鉴定及其对溴氰菊酯胁迫的响应表达

【目的】为明确星豹蛛Pardosa astrigera体内2个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs)基因的时空表达模式，并探究其是否能对溴氰菊酯的胁迫做出响应。【方法】基于星豹蛛转录组数据库，PCR克隆星豹蛛GST基因PaGSTd1和PaGSTd2全长cDNA序列并进行生物信息学分析；利用RT-qPCR检测PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛不同发育阶段(2-6龄若蛛和成蛛)、雌雄成蛛不同组织(头胸部、腹和足)以及通过药膜法利用不同浓度[LC₁₀(5.151 mg/L), LC₃₀(8.619 mg/L)和LC₅₀(12.311 mg/L)]溴氰菊酯胁迫不同时间(6, 12, 18, 24和48 h)雄成蛛中的表达量。【结果】星豹蛛PaGSTd1(GenBank登录号：OR096398)全长cDNA序列长708 bp,开放阅读框长645 bp,编码214个氨基酸；星豹蛛PaGSTd2(GenBank登录号：OR096399)全长cDNA序列长793 bp,开放阅读框长64...     

湖北海棠MhPR1a基因的克隆与表达特性分析

以水杨酸诱导的湖北海棠[ Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.]全长cDNA文库和基因组DNA为模板,克隆其PR1a基因(MhPR1a)的全编码区序列,并对该序列进行生物信息学分析;在此基础上利用荧光定量RT-PCR技术对湖北海棠根、茎和叶中该基因的表达特性及经过10μmol·L-1ABA、4℃低温处理及苹果蚜虫(Aphis citricola van der Goot)侵染后叶中该基因的表达特性进行了测定.结果表明:克隆获得的MhPR1a基因全长518 bp,最大开放阅读框为492 bp,编码162个氨基酸残基;编码的蛋白质为酸性蛋白,其相对分子质量为16 960,等电点pI 5.46;其基因组DNA序列与cDNA序列完全一致,说明MhPR1a基因内部没有内含子.湖北海棠MhPR1a基因与苹果(M.domestic Borkh.)和沙梨[Pyrus pyrifolia( Burm.f.)Nakai] PR1基因的cDNA序列及其编码的氨基酸序列同源性均较高,其中cDNA序列的同源性均为97％,氨基酸序列的同源性分别为95％和97％;系统树也显示MhPR1a基因编码的氨基酸序列与苹果和沙梨的亲缘关系最近,聚为一类.MhPR1a基因编码的氨基酸序列具有SCP保守结构域,含有1个信号肽和6个保守的半胱氨酸残基.在湖北海棠的叶、茎和根中MhPR1a基因均能表达,在根中的表达量最高.10 μmol·L-1ABA和4℃低温处理48 h后均可诱导MhPR1a基因的表达,且相对表达量明显高于对照(处理0h);苹果蚜虫也可诱导MhPR1a基因的表达,说明MhPR1a基因在湖北海棠抵抗植食昆虫和低温胁迫的过程中可能发挥着重要作用.