CS3菌毛抗原和霍乱毒素B亚基在人伤寒菌中的表达

通过体内外重组的方法,构建了人伤寒菌流行株Ｔｙ２的△ａｒｏＡ,△ａｒｏＣ和ａｓｄ＾－基因缺失突变体（ＲＳ４１７）作为抗原载体菌：同时,构建包含ａｓｄ基因的表达质粒ｐＹＸ１０２,与ＲＳ４１７一起,构成宿主－载全平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因,将肠毒素性大肠杆菌的菌毛抗原ＩＩＩ（ＣＳ３）基因和霍乱弧菌毒素Ｂ亚基（ＣＴＢ）基因分别克隆至ｐＹＸ１０２     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

肠毒素源性定居因子CS6在减素伤寒沙门氏菌中表达及免疫原性的研究

将编码肠毒素源性大肠杆菌定居因子抗原ＣＳ６基因克隆到ｐＸＬ６７０,转化ａｓｄ基因突变的Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ６０９７,获得重组质粒ｐＳＳ６４,再将后者转化至减毒的△ａｒｏＡ、△ａｒｏＣ、△ａｓｄ伤寒沙门氏菌,构建了无药物抗性且稳定的大肠杆菌和伤寒双价菌苗候选株。小鼠腹腔免疫和攻击实验表明,该菌株对伤寒沙门氏菌毒株的攻击具有良好的保护作用。家兔免疫实验证明,该菌株能产生抗ＣＳ６和伤寒菌Ｖｉ抗原的血清抗体。     

PAI—2及其突变体的生物化学性质

为研究和比较纤深酶原激活剂抑制物２型（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ ２,ＰＡＩ－２）及其突变体的生物化学性质,用ＰＣＲ、体外定点突变技术构建ＰＡＩ－２突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ,将突变体ｃＤＮＡ与原核表达载体重组并转化怕杆菌。经诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实表达出相应蛋白质,均占全菌总蛋白的１４％。Ｗｅｔｅｒｎ印迹、溶圈抑制及纤维蛋白翻转板     

人精子膜蛋白片段在沙门氏菌中的表达——一种制备抗生育疫苗的途径

合成编码一种人精子膜蛋白ＹＷＫ－Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核苷酸链,ＨＳＤ－２ａ。用平端连接的方法将其插入到沙门氏菌鞭毛基因ｆｌｉＣ（ｄ）的抗原表位ＩＶ高变区ＥｃｏＲＶ位点,构建了重组质粒ｐＬＳ４０８－Ｈ１。重组基因在鞭毛负性ａｒｏＡ基因缺失的无致病性沙门氏菌Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ ＳＬ５９２８疫苗菌株中表达。经ＥＬＩＳＡ、电镜免疫胶体金法检测,表明ＨＳＤ－２ａ编码的多肽片段成功地在沙门氏菌鞭毛表面     

不同频率电刺激膈神经导致膈肌肌浆网Ca~(2 )-ATPase和Ca~(2 )释放-摄取动力学改变

研究不同频率慢性电刺激（ＣＥＳ）后兔膈肌肌浆网（ＳＲ）Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性以及ＳＲ Ｃａ２＋摄取－释放动力学对不同频率ＣＥＳ的适应性变化。建立不同频率ＣＥＳ组;用定磷法测定ＳＲ Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性;用Ｆｕｒａ－２荧光法测定ＳＲ　Ｃａ２＋摄取－释放动力学。与对照组比较,慢性低频电刺激１０ Ｈｚ和２０Ｈｚ组的ＳＲ　Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性明显降低（Ｐ＜０．０１）,Ｃａ２＋释放－摄取动力学也显著降低（Ｐ＜０．０１）;慢性高频电刺激５０ Ｈｚ和１００Ｈｚ组的ＳＲ Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性则显著升高（Ｐ＜０．０１）,Ｃａ２＋释放－摄取动力学亦明显升高（Ｐ＜０．０１）。实验提示,ＣＥＳ后不同频率ＣＥＳ导致膈肌ＳＲＣａ２＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ２＋摄取－释放动力学产生不同的适应性变化;对不同功能状态的膈肌应用不同频谱的慢性电刺激可能具有重要的临床意义。     

大肠杆菌苯丙氨酸生物合成关键酶的串联表达

ａｒｏＧ基因编码的 ３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ　Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ　ＤＳ）和 ｐｈｅＡ基因编码的分支酸变位酶／预苯酸脱水酶（Ｃｈｏｒｉｍａｔｅ ｍｕｔａｓｅ／ Ｐｒｅｐｈｅｎａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ,ＣＷ／ＰＤ）都是本丙氨酸合成途径中的关键酶,为了通过基因工程手段来增加本丙氨酸生物的产量,在利用高效的原核表达载体ｐＢＶ２２ ０对ｐｈｅＡ基因编码的ＣＭ／ ＰＤ 酶进行了表达的基础上,采用ＰＣＲ方法扩增了抗反馈抑制的ａｒｃＧ基因,进行克隆表达,并与ｐｈｅＡ基因串联,以ＰＲＰＬ－ａｒｏＧ－ＰＬ－ｐｈｅＡ的形式,实现了２种酶基因在大肠杆菌中的表达, ＳＤＳＰＡＧＥ 图谱显示了新增的４３ｋｕ及３５ｋｕ蛋白带,经酶活性测定ＤＳ、ＣＭ／ＰＤ酶的比活分别提高了 ４．６７倍、８０５／１０．７１倍。     

小鼠4.5S RNA逆转座子对Luc基因表达的影响

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从小鼠肝脏组织总ＲＮＡ中扩增出４．５ＳＲＮＡ的ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ被克隆到ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）质粒上,酶切鉴定并测序。然后将该序列插入以Ｌｕｃ基因作为报道基因的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０的ＰｖｕⅡ位点,构建了含４．２ＳＲＮＡ逆转座子的表达载体ｐＳＶｌｕｃ２０－４．５Ｓ。脂质转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１、ＳＰ２／０和人乳腺癌细胞Ｂｃａ６１。结果表明,小鼠４．５ＳＲＮ     

大肠杆菌aroG基因的克隆表达及与pheA、tyrB基因的串联表达

３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ）是苯丙氨酸合成途径中关键酶之一,在大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码。本文用ＮＴＧ诱变得到对苯丙氨酸类似物间氟苯丙氨酸（ｍＦＰ）和对氟苯丙氨酸（ｐＦＰ）有抗性的大肠杆菌突变株,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到了ａｒｏＧ基因,在大肠杆菌中进行了表达。结果表明,该基因能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下得到表达,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳图上出现清晰的条带,酶的比活提高了１．７倍。在ｐｈｅＡ（编码分枝酸变位酶ＣＭ和预苯酸脱水酶ＰＤ）、ｔｙｒＢ（编码苯丙氨酸转氨酶ＰＡＴ）基因克隆、串联克隆和表达完成的基础上,将ａｒｏＧ基因和ｐｈｅＡ、ｔｙｒＢ基因以ａｒｏＧ－ｐｈｅＡ－ｔｙｒＢ的顺序三基因串联到表达载体进行表达,酶活测定结果表明,三个基因都能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下表达,与对照菌株相比,酶比活分别提高了１．７倍、１３．９／７．８倍和２．３倍。     

StxB／HlyA（CT）融合蛋白的分泌表达和StxB在小鼠内的特异免疫反应

本文将志贺氏毒Ｂ亚单位（ＳｔｘＢ）与大肠杆菌溶血素Ａ的Ｃ末端（ＨｌｙＡ（ＣＴ））相融合,蛋白ＳｔｘＢ／ＨｌｙＡ（ＣＴ）不仅能在大肠杆菌中分泌到胞外,而且也能从ａｒｏＡ突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌中分泌出去。当用高拷贝质粒ｐＵＣ１８作载体时,上述融合蛋白对宿主细胞有毒性,但以低拷贝质粒ｐＢＲ３２２取代之后,该融合蛋白不再对窠主细胞产生任何不利影响。融合蛋白ＳｔｘＢ／ＨｌｙＡ（ＣＴ）无论是在ａｅｒｏｂａｃ     

p35Nck5a基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复,采用常规的分子克隆技术,构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞,经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择,获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆,细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复,同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。     

无标签鼠疫耶尔森菌V抗原突变体在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的：在大肠杆菌中表达、纯化无标签鼠疫耶尔森菌低钙反应Ｖ抗原突变体,并对其免疫原性进行研究。方法：采用融合ＰＣＲ方法将Ｖ抗原基因中编码半胱氨酸的碱基缺失突变,将获得得Ｖ抗原突变体基因克隆到原核表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）后转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导表达并进行柱层析纯化,纯化产物以Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹进行鉴定并免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,通过ＥＬＩＳＡ检测免疫血清效价。结果：目的蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性高表达,经三步柱层析后纯度高于９５％,经Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测可与野生型Ｖ抗原单克隆抗体特异性结合,免疫小鼠后获得高效价免疫血清。结论：获得了无标签的鼠疫耶尔森菌Ｖ抗原突变体蛋白,并证实其具有免疫原性,将对Ｖ抗原结构和功能的研究提供帮助。     

箬叶多糖及其化学修饰物、亚硒酸钠和GSH对Cu~(2+)诱导的LDL氧化修饰的保护作用

研究了箬叶多糖ＦⅢ－ａ及其化学修饰物、亚硒酸钠和ＧＳＨ对Ｃｕ２＋诱导的低密度脂蛋白氧化修饰的保护作用．其结果表明箬叶多糖、硫酸酯多糖、硒酸酯多糖可显著抑制脂质过氧化产物（ＴＢＡＲＳ）及荧光物质的生成,彼此之间无明显差异．但对ＶＥ的消耗有着不同的保护作用,其顺序是ＦⅢ－ａ＞Ｓ－ＦⅢ－ａ＞Ｓｅ－ＦⅢ－ａ,并且具有明显的量效关系．硒或ＧＳＨ对Ｃｕ２＋诱导的ＬＤＬ氧化修饰无明显的抑制,但联合使用在０．１２５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＳｅＯ３和０．２ｍｍｏｌ／ＬＧＳＨ及１２．５μｍｏｌ／ＬＮａ２ＳｅＯ３和０．０２ｍｍｏｌ／ＬＧＳＨ的浓度下能强烈地抑制ＴＢＡＲＳ的生成,甚至比正常的ＬＤＬ还要低．但是对ＶＥ的消耗只有较弱的保护作用,硒酸酯多糖与此相似．Ｎａ２ＳｅＯ３在０．１２５ｍｍｏｌ／Ｌ时可以明显抑制荧光物质的生成．     

血管紧张素Ⅱ对大鼠心肌肌浆网Ca~(2+),Mg~(2+)-ATPase基因转录调节的影响

观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）对心肌肌浆网Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰａｓｅ基因（ＳＥＲＣＡ２ａ）转录调节的影响,评价ＤＭＰ８１１对此效应的干预作用．６周龄雄性ＳＤ大鼠随机分为３组,每组６只．组１：生理盐水输注;组２：ＡｎｇⅡ输注＋ＤＭＰ８１１管饲（３ｍｇ·ｄ－１·ｋｇ－１）;组３：ＡｎｇⅡ输注（２００ｎｇ·ｍｉｎ－１·ｋｇ－１．１周后称其体重,取心脏并称重,提取心脏总ＲＮＡ后采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ的方法检测ＳＥＲ－ＣＡ２ａ的转录水平,采用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＡｎｇⅡ１型受体（ＡＴ１）ｍＲＮＡ水平．实验后,组３心重（ＣＷ）、心重／体重（Ｃ／Ｂ）、ＡＴ１受体转录水平均高于组１（分别增加４．７±０．４％,４．９±０．９％和２４．７±３．５％;Ｐ＜０．０１）,而ＳＥＲＣＡ２ａ基因转录水平显著低于组１（降低２０．１±３．０％,Ｐ＜０．０１）,并且ＳＥＲＣＡ２ａｍＲＮＡ水平与ＡＴ１受体ｍＲＮＡ水平呈负相关（ｒ＝－０．７４,Ｐ＜０．０１）．ＡｎｇⅡ导致的上述改变能被ＤＭＰ８１１完全阻断．ＡｎｇⅡ通过其Ⅰ型受体的介导,诱导了ＳＥＲＣＡ２ａ的转录下调     

大肠杆菌AroG蛋白F209S突变体对苯丙氨酸反馈抑制作？…

在大肠杆菌中,８０％的３－脱氧－Ｄ－阿拉伯－庚酮－７－磷酸（３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ａｒａｂｉｎｏ－ｈｅｐｔｕｌｏｓｏａｔｅ ７－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ,ＤＡＨＰ）合酶由ａｒｏ基因编码。分别以大肠杆菌Ｋ１２及其抗苯丙氨酸类似物的突变体总ＤＮＡ为模板,以ＰＣＲ方法扩增得到ａｒｏＧ基因及其突变。基因测序结果表明抗苯丙氨酸灯似物的突变体,其ａｒｏＧ基因核苷酸６２５位发生了Ｔ→Ｃ的点突变,从而使ＡｒｏＧ蛋白的２０     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体蛋白基因的属性

通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交发现高毒力苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＴＢＴ－１５２０菌株含有两个杀虫晶体蛋白基因片段,其５’＝末端所在ＨｉｎｄⅢ片段分别为６．８ｋｂ和４．６ｋｂ,它们对应的基因分别命名为ｃｒｙ２１８和ｃｒｙ４．６。经ＰＣＲ鉴定,该菌含有ｃｒｙ１Ａａ、ｃｒｙ１Ａｂ和ｃｒｙ１Ａｃ基因,以及ｃｒｙ２基因,其中ｃｒｙ２１８属于ｃｒｙ１Ａｃ。分析了ｃｒｙ１Ａｃ基因     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究

根据已知基因序列,利用ＰＣＲ技术,从克隆质粒和欧文氏菌（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＣＢ１２５染色体中重新扩增得到含有２－酮基醛糖还原酶Ａ和Ｂ（２－ＫＲＡ和Ｂ）基因的片段,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体ｐＢＬ并转化大肠杆菌ＢＨ５α后,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到ｔｋｒＡ内部使其突变失活     

大肠杆菌aroG基因的克隆表达及与pheA,tyrB基因的？…

３－脱氧－２－阿拉伯庚酮糖－７－磷酸合成酶（ＤＡＨＰ）是苯丙氨酸合成途径中关键酶之一,在大肠杆菌中由ａｒｏＧ基因编码。本文用ＮＴＧ诱变得到对苯丙氨酸类似物间氟苯丙氨酸（ｍＦＰ）和对氟苯丙氨酸（ｐＦＰ）有抗性的大肠杆菌突变株,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到了ａｒｏＧ基因,在大肠杆菌中进行了表达。结果表明,该基因能在λ噬菌体的ｐＲ启动子驱动下得到表达,在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳图上出现清晰的条带