柳树黄化病植原体的分子分类

[目的]柳树黄化病是一种重要的植原体病害,本研究旨在明确柳树黄化病植原体(Willow Yellow phytoplasma,WY)的分类地位,为进一步开展致病性和防治研究奠定基础.[方法]采用植原体特异引物通过PCR方法从患病植株DNA中扩增植原体16S rDNA基因和核糖体蛋白基因(ribosomal proteins gene,rp),对所得的序列进行分析,构建同源进化树,并用限制性片段长度多态性(RFTJP)对巢式PCR产物进行分析.[结果]首次从柳树黄化病植原体中分离出了16S rDNA基因和rp基因,大小分别为1246 bp和1212 bp.通过对植原体16S rDNA和rp基因的核苷酸同源性比较和RFLP分析,发现该分离物与16S rI组的核苷酸同源性均在99%以上,与16S rI-C亚组中的小麦蓝矮病植原体同源性高达99.8%(16Sr DNA)和99.6%(rp),且RFLP分析与16SrI-C亚组的植原体有相同的酶切条带.[结论]柳树黄化植原体应划分于16SrI-C亚组.     

坡柳(Dodonaea viscosa L.)丛枝植原体新病原的分子鉴定

从四川攀枝花芒果园中表现为丛枝、小叶和黄花等症状的坡柳植株发病样品中,利用植原体16S rDNA基因的通用引物R16m F2/R16m R1和R16F2n/R16R2,对发病植株总DNA进行巢式PCR检测,同时设计植原体抗原膜蛋白基因(AntMP)的保守引物AntMP-F/AntMP-R进行PCR验证。结果显示,坡柳样品巢式PCR的第一轮、第二轮DNA条带大小分别为1 400 bp和1 200 bp左右,经NCBI序列相似性比较均为植原体16S rDNA序列,Gen Bank登录号为KT957205和KT957206;PCR结果显示抗原膜蛋白基因大小约600 bp,与目标基因大小一致。将测得的16S rDNA基因序列与Gen Bank数据库中登录的16SrⅠ~ⅩⅤ组植原体16S rDNA序列进行同源性比对,构建系统进化树,结果显示四川坡柳丛枝植原体(DOVI-SC)属于16SrⅠ组(即翠菊黄花组),与已报道的5个16SrⅠ组(AY101386,AY566302,AY389822,L33760和KP662119)同属一个组。利用植原体亚组分类鉴定软件iPhy Classfier对获得的2条植原体16S rDNA序列进行虚拟RFLP分析,结果显示KT957205,KT957206与16SrⅠ-B亚组洋葱黄化植原体(NC-005303)相似度分为1.0、0.97,归属于16SrⅠ-B亚组。本研究对引起四川坡柳丛枝的植原体病原进行检测,为坡柳植原体病害的早期诊断、快速检测以及预防措施制定提供科学线索。     

用PCR及RFLP方法分析支原体与植原体的同源性

将猪鼻支原体和泡桐丛枝病植原体的16S rDNA进行PCR扩增,分别得到一条1 kb左右的扩增片段。PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ和SmaⅠ进行RFLP(限制性片段长度多态性)分析,发现用RFLP分析猪鼻支原体和泡桐丛枝病植原体16S rDNA序列同源性的相关系数为0.72。     

新疆小叶白蜡丛枝病植原体的鉴定及16S rRNA基因序列分析

【目的】对新疆小叶白蜡丛枝病植原体进行检测,通过其16S rRNA基因分析确定其分类地位。【方法】利用苯胺蓝和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,在荧光显微镜下观察新疆小叶白蜡嫩茎横切片;采用植原体16S rRNA基因的通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行直接和巢式PCR扩增,对得到的16S rRNA基因的序列进行RFLP和构建系统进化树分析。【结果】表现丛枝病症状的新疆小叶白蜡中存在植原体,暂命名为Fraxinus sogdianaBunge witches’broom phytoplasma(Fraxinus sogdianaBunge WB);其16S rRNA基因的序列GenBank登录号为KF061042,RFLP图谱与16Sr V-B亚组的枣疯病植原体相同,系统进化地位与枣疯病菌株AB052876相同。【结论】新疆小叶白蜡丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。     

泡桐丛枝植原体16S rDNA和延伸因子基因序列分析

对采自陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省的泡桐丛枝病材料,利用巢式扩增,均得到16S rDNA基因片段约1.2kb;扩增得到植原体延伸因子(EF-Tu)tuf基因,长度约为850bp.。通过将16S rDNA基因片段和延伸因子(EF-Tu)tuf基因序列与已知植原体16Sr各组成员进行同源性比较,确定我国大陆泡桐主栽区陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省与已经报道的台湾省泡桐丛枝植原体基本一致,均为同一个种,没有株系的分化,全部归属于植原体16SrI-D组,从而确定了其分类地位。     

金沙江干热河谷区胡枝子（Lespedeza Michx）根瘤菌多样性及其系统发育

研究利用数值分类、BOXAIR-PCR指纹图谱、16SrDNA PCR-RFLP、16S rDNA和GSⅡ序列分析等方法,研究了分离自金沙江干热河谷区的86株胡枝子根瘤菌的多样性和系统发育,结果表明金沙江干热河谷区胡枝子根瘤菌蕴涵丰富的生物多样性。通过数值分类,供试未知菌株表现出极大的表型性状多样性,能耐高温（60℃）和低pH（4.0）,在低温（10℃）或者高pH（9.0）条件下生长很差,耐盐性也很差。供试未知菌株的16S rDNA用HaeⅢ、MspⅠ、HinfⅠ和TaqⅠ酶切后具有16种遗传图谱类型,其中10株供试未知菌的16S rDNA遗传图谱类型不同于所选用的已知参比菌株。BOXAIR-PCR的分群结果分散,很多在16S rDNA PCR-RFLP中具有相同遗传类型的菌株也表现较大差异,表明了供试菌株在基因组水平上差异很大。序列分析结果表明,6株代表菌株分布于Rhizobium、Sinorhizobium、Mesorhizobium、Bradyrhizobium4个属,16S rDNA序列与GSⅡ序列分别构建的系统发育树在属水平上基本一致,但16S rDNA序列的同源性比GSⅡ高,6株代表菌株间16S rDNA序列的同源性在87.5%～99.5%之间,GSⅡ序列的同源性在79.4%～89.8%之间;而代表菌株与亲缘关系最近的参比菌株间的16S rDNA序列的同源性为99.9%～100%,GSⅡ的同源性为88.9%～99.6%。     

中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析

摘要：【目的】检测不同地区枣树品种上的枣疯植原体侵染及保守基因序列的变异。【方法】利用植原体16S rDNA的通用引物R16mF2／R16mR1、16S-23S间区序列(SR)的通用引物SR1/SR及secY基因引物FD9f/r,通过PCR检测采自国内7个地区14个枣树品种上的32个枣疯病和4个酸枣丛枝病样品。将PCR产物进行直接或克隆测序,结合已报导的测序数据,进行序列同源性和系统进化分析。【结果】所有枣疯病样品中均检测到植原体;皆属于榆树黄化16S rV-B亚组,与我国重阳木丛枝和樱桃致死黄化遗传关系     

泰安枣疯病植原体的分子鉴定

【目的】对3个枣疯病病原物泰安株系进行分子鉴定。【方法】采用植原体通用引物对R16F2n/R16R2,通过直接PCR技术,扩增枣疯病植原体16S rDNA基因,通过16S rDNA基因序列分析和在线模拟16S rDNA-RFLP分析,并将其16S rDNA基因序列提交到GenBank数据库。【结果】3个枣疯病病原物16S rDNA基因片段与16SrⅤ-B亚组中枣疯病植原体(AB052876和AF279272)、樱桃致死黄化植原体(AY197659)及杏卷叶植原体(FJ572660)的同源性高达99.5%99.7%,分别命名为枣疯病植原体泰安圆铃1号株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Yuanling1,JWB-Yuanling1,TA)、枣疯病植原体泰安鲁北冬枣株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Lubeidongzao,JWB-Lubeidongzao,TA)和枣疯病植原体泰安大白铃株系(Jujube witches’-broom phyto-plasma strain Dabailing,JWB-Dabailing,TA),基因登录号分别为:HM989946、HM989947和HM989948。【结论】3个枣疯病植原体泰安株系均归属于16SrⅤ-B亚组。     

仙人掌丛枝病植原体CWB1株系16SrRNA基因克隆及序列分析

对表现丛枝症状的仙人掌植株总DNA进行植原体 1 6SrRNA基因PCR扩增 ,得到一条约 1 5kb的特异片段 ,表明植株中有植原体存在 ,将此植原体株系命名为CWB1。把此特异片段与pGEM Teasy载体连接并转化到大肠杆菌JM1 0 9感受态细胞中 ,通过PCR鉴定、限制性内切酶 (EcoRI)酶切分析及核苷酸序列分析 ,均表明克隆成功。序列分析结果显示 ,此株系的 1 6SrRNA基因全长 1 489个碱基 ,与属于植原体 1 6SrⅡ C亚组的Fababeanphyllody植原体同源率最高 ,为 99 7%。通过 1 6SrRNA基因核酸序列同源性比较 ,认为该株系属于 1 6SrⅡ C亚组 ,基本确定了其分类地位。     

几种分子生物学方法在菌种鉴定中的应用

REP-PCR指纹法、PCR-RFLP分析法、16S rDNA序列分析法在生物多样性研究、菌种鉴定、及微生物资源的开发应用中得到了广泛的应用,但最高分辩能力及适用性各不相同。该文采用上述方法对从厦门温泉分离刊的嗜热菌进行了鉴定分析,并对GeneBank数据库中的同源性较近的细菌16S rDNA序列进行比较,结果发现：在这三种鉴定方法中,REP-PCR法最简单,分辨能力最强,可鉴别16S rDNA序列同源性大于99.5％甚至完全相同的不同菌株;16S rDNA分析能快速准确地对微生物进行分类鉴定,它在分类学中的核心地位不可替代,但当16S rDNA序列同源性大干99.5％时难以获得准确的鉴定结果;PCR-RFLP法分辨力弱,可用于种到属水平的研究,16S rDNA序列相似性在96％以上,酶切图谱就难以区分了,但在不经过微生物分离培养的原位微生物多样性的研究中仍具有重要的作用。     

陕西太白尾矿废弃地豆科植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP及全序列分析

应用16S rDNA-RFLP和16S rDNA全序列测定方法,对分离自陕西太白金矿尾矿废弃地的55株根瘤菌和12株参比菌株进行了遗传多样性和系统发育地位研究。采用平均连锁法(UPMGA)对16S rDNA PCR-RFLP聚类,结果显示所有菌株在72%的水平上聚到一起。根据参比菌株的种属关系,将供试菌株初步分成6个遗传发育群。群Ⅰ为根瘤菌属,群Ⅱ为中华根瘤菌属,群Ⅲ是中慢生根瘤菌属,群Ⅳ为土壤杆菌属,群V为一未知群,群Ⅵ为慢生根瘤菌属。分离自天蓝苜蓿的根瘤菌主要分布在群Ⅱ,截叶胡枝子根瘤菌在各个群内均有分布,表现出丰富的遗传多样性。选取群Ⅰ、Ⅱ的代表菌株TB17-1、TB50-1进行16S rDNA全序列测定分析,结果显示TB17-1与Rhizonbium leguminosarumUSDA2370的同源性高达99.7%,TB50-1与Sinorhizobium melilotiLMG6133的同源性为100%。全序列测定结果与RFLP分析结果基本一致。     

狗牙根白化病植原体16S rDNA序列

[目的]狗牙根(草坪草的一种)白化病是狗牙根的一种重要病害,在全世界均有分布.为了确定中国大陆狗牙根白化病病原,进一步与世界其他地区的病原相比有无特异性.[方法]采用植原体16S rDNA PCR扩增、序列分析、Southern分子杂交等技术对狗牙根健康植株及白化病患病植株进行研究.[结果]仅白化病植株扩增获得1.3 kb的特异片段,序列分析表明特异片段与CandidatusPhytoplasm Cynodontis有99%同源性.Southern杂交有特异条带,大小在预期范围之内.证实了在中国大陆发生的狗牙根健株型白化病病原含有植原体.[结论]大陆狗牙根白化病病原中含有植原体,为该病病原的进一步鉴定与防治奠定了基础.     

油藏水样细菌群落16S rRNA基因的RFLP分析

通过16S rRNA基因的限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)方法,考察了油藏水样中细菌群落及多样性。从水样中分离纯化微生物总DNA,选择性扩增细菌16S rRNA基因,并构建16S rDNA克隆文库。337个16S rDNA克隆片段分别用限制性内切酶HinfⅠ和HaeⅢ酶切分析,得到74个操作分类单元(OTUs),其中数量最多的4个OTUs共占克隆子总数的73.6%,另外70个OTUs的丰度均处于较低水平,有57个OTUs仅含有1个克隆子。结果表明,运用RFLP方法分析16S rDNA克隆片段能够有效评估油藏水样中的细菌群落和多样性。     

金沙江干热河谷区田菁根瘤菌多样性与系统发育

[目的]揭示金沙江干热河谷区这一特殊地理环境下田菁根瘤菌的多样性和系统发育地位. [方法]采用了数值分类、16S rDNA PCR-RFLP、16S rDNA和GSⅡ序列分析方法.[结果]数值分类结果表明:在93%的水平上,待测菌株分布于6个群,其中4个群分别与R.tropici、 R.etli、 S.saheli、A.rubi的参比菌株聚在一起,两个群没有参比菌株与之聚群.16S rDNA PCR-RFLP结果与数值分类基本一致,只有两个独立群有所差异.16S rDNA序列分析表明:两独立群中心菌株SCAU176 和SCAU144与R.huautlense聚在一起,与该种同源性分别为100%和98.9%.GSⅡ序列分析中SCAU176 和SCAU144单独聚在一起,与最近的参比菌株R.tropici的同源性系数在90%以下.[结论]金沙江干热河谷区田菁根瘤菌具有较为丰富的多样性,在系统发育地位上分布于Sinorhizobium、Agrobacterium和Rhizobium三个属.     

新疆泥火山细菌遗传多样性

为了解新疆乌苏泥火山细菌多样性,从泥火山泥浆样品中直接提取总DNA,构建了含150个有效转化子的泥火山细菌16S rDNA基因文库,转化子经菌液PCR及HaeⅢ酶切后获得16个不同带型,克隆测序结果表明,其分属于16个不同的分类单元.一部分序列与已知细菌类群的16S rDNA序列相似性较高,归属变形菌门(Proteobacteria),厚壁菌门(Firmicutes),梭杆菌门(Fusobacteria),放线菌门(Actinobacteria);另外一部分序列与已知细菌类群的16S rDNA序列同源性较低,可能代表新的分类单位.研究结果显示,泥火山环境中微生物种群丰富,值得进一步研究.     

杏褪绿卷叶植原体新疆分离物核糖体蛋白基因的克隆与序列分析

【目的】了解杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的系统发育关系及遗传分化,确定其分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白(rp)基因的特异性引物rpF1/rpR1对新疆轮台县托克逊县杏褪绿卷叶病植株总DNA进行PCR扩增,并对部分扩增片段克隆、测序及序列分析。【结果】获得杏褪绿卷叶植原体新疆分离物rp基因片段大小为1196 bp,该片段包含部分rpS19以及rpL22和rpS3基因的全部序列。序列相似性和系统进化分析表明,杏褪绿卷叶植原体新疆分离物与16SrⅤ-rp亚组中的各代表性植原体的rp基因核苷酸序列相似性达到95.7%~99.3%,其中与rpⅤ-C亚组的甜樱桃绿化植原体和枣疯病植原体的相似性最高,核苷酸及氨基酸相似性分别达到99.2%~99.3%和98.3%~98.4%。进一步虚拟RFLP分析,发现杏褪绿卷叶植原新疆分离物rp基因的酶切图谱与rpⅤ-C亚组成员相似性最高,但在MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位点上存在差异。综上初步判断其可能属于16SrⅤ组(榆树黄化组)中的一个新rp亚组。【结论】本研究首次报道了杏褪绿卷叶植原体新疆分离物的rp基因序列,确定了其分类地位,为杏褪绿卷叶病的早期诊断和检测提供了基础。     

海绵Pachychalina sp.体内细菌多样性的研究

通过非分离培养分析方法,直接从海绵体内提取细菌总DNA。以样品总DNA为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA。用16S rDNA限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp．体内的细菌多样性进行了研究。在细菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱间存在差异;随机挑选22个克隆进行测序得到它们的16S rDNA部分序列,大部分序列属于γ-proteobacterium和α-proteobacterium,但有少数克隆序列与RDP数据库中收录的16S rDNA序列间的相似性极小,不参与系统发育树的构建。研究结果表明海绵Pachychalina sp.体内细菌组成具有丰富的多样性。     

海绵Pacnychalina sp.体内古菌多样性非培养技术分析

采用非分离培养分析方法,即16S rDNA限制性酶切片段长度多态性(ARDRA)和测序方法对南海湛江海域海绵Pachychalina sp.体内的古菌多样性进行了研究.从海绵体内直接提取古菌总DNA.以样品总DNA为模板,用古菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增获得16S rDNA,回收、纯化16S rDNA产物并克隆到T-Vector.进行第二次PCR扩增反应,且对扩增产物进行ARDRA.在古菌16S rDNA的ARDRA图谱中,大多数克隆的酶切带谱上存在差异;随机挑选8个克隆子进行测序,获得古菌16S rDNA的部分序列,并对16S rDNA序列进行聚类分析构建了系统进化树,结果发现海绵体内的古菌主要属于Methanogenium organophilum、Methanoplanus petrolearius等古菌类.但它们与目前数据库中收录的古细菌间的相似性均不超过90%,它们极有可能是一些新的古菌.     

川中丘陵地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育关系

【目的】研究分离自川中丘陵地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因、glnII、共生基因(nodC)系统发育分析的方法进行研究。【结果】供试未知菌的16S rDNA用4种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ)酶切后获得5种16S遗传图谱类型。16S rDNA PCR-RFLP结果表明,所有供试菌株在83%水平分为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和中华根瘤菌属(Sinonrhizobium)两大类群,而75%的菌株为中华根瘤菌。6个代表菌株的16S rDNA、glnII和nodC三个位点基因的系统发育结果基本一致,4株与S.fredii USDA205T相似度最高;有2株分别与B.yuanmingense CCBAU10071T、B.diazoefficiens USDA110T相似度最高。4个Sinonrhizobium代表菌株16S rDNA、glnII序列相似度分别为98.3%-99.9%、98.2%-100%,但它们的nodC基因序列完全相同。【结论】川中丘陵地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii为优势种。     

垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

利用特异性的引物对,选择性扩增垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的18S rRNA基因片断,在此基础上建立16S rDNA克隆文库,经古细菌通用寡核苷酸探针的原位杂交筛选后,克隆文库内古细菌16S rDNA扩增片断的多样性通过ARDRA分析（amplified rDNA restriction analysis)而获得,利用PCR将各组重克隆子内的16S rDNA外源片断再扩增出来后,两种限制性内切酶－Hha I和HaeⅢ－被分别用于16S rDNA克隆片断的限制酶切分析,结果表明,随机选出的70个古细菌16S rDNA克隆片断被妥为21个不同的ARDRA型（组）,其中的两个优势型总共占了所有被分析克隆子的60％,而其余19个型的相对丰度均处于较低的水平,当中的14个型更仅含有1个克隆子,通过对16S rRNA基因的PCR扩增,克隆及其ARDRA分析,能快速地获得有关填埋场渗滤液中古细菌群落的结构及其多样性的初步信息。