甘薯丛枝病植原体的PCR检测

以报道的植原体（Phytoplasma)16SrDNA基因保守序列为依据,设计合成了两对引物对R16mF2/R16mR2和R16F2／R16R2,以甘薯丛枝病（SPWB）带病植株的叶脉中提取的DNA为模板,应用聚合酶链式反应（PCR）技术和巢式PCR（Nested-PCR)技术对甘薯丛枝病病原进行分子检测。结果表明PCR扩增出了1．5kb的特异片段,在PCB基础上的巢式PCR扩增出了1．2kb的特异片段,灵敏度实验显示该方法所需PCR模板DNA量为0．1073ng/ul在PCR的基础上的巢度PCR可以将灵敏度提高约10000倍,所需模板DNA仅为0．01073pg/ul,在甘薯丛枝病的检测中是一种快速,灵敏,可靠的方法。     

新疆小叶白蜡丛枝病植原体的鉴定及16S rRNA基因序列分析

【目的】对新疆小叶白蜡丛枝病植原体进行检测,通过其16S rRNA基因分析确定其分类地位。【方法】利用苯胺蓝和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,在荧光显微镜下观察新疆小叶白蜡嫩茎横切片;采用植原体16S rRNA基因的通用引物对P1/P7和R16F2n/R16R2进行直接和巢式PCR扩增,对得到的16S rRNA基因的序列进行RFLP和构建系统进化树分析。【结果】表现丛枝病症状的新疆小叶白蜡中存在植原体,暂命名为Fraxinus sogdianaBunge witches’broom phytoplasma(Fraxinus sogdianaBunge WB);其16S rRNA基因的序列GenBank登录号为KF061042,RFLP图谱与16Sr V-B亚组的枣疯病植原体相同,系统进化地位与枣疯病菌株AB052876相同。【结论】新疆小叶白蜡丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员。     

香蕉束顶病植原体16S rDNA片段的RFLP和序列分析

香蕉束顶病（ＢＢＴ）是一种发生在蕉类作物的严重病害。从带有典型香蕉束顶病症状的香蕉植株中按照检测植原体的方法提取ＤＮＡ,扩增患病植株中植原体１６ＳｒＤＮＡ片段,证明香蕉束顶病中有植原体存在。对此扩增片段进行限制性酶切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析和核酸序列分析,并与已知植原体的序列进行同源性比较,构建进化树。结果显示该片段与Ｇｒ１的亲缘关系最近。     

香蕉束顶病植原体16S rDNA片段的RFLP和序列分析

香蕉束顶病（ＢＢＴ）是一种发生有蕉类作物的严重病害,从带有典型香蕉束顶病症状的香蕉植株中按照检测植原体的方法提取ＤＮＡ,扩增患病植株中植原体１６ＳｒＤＮＡ片段,证明香蕉束顶病中有植原体存在,对此扩增片段进行限制性酶切片长度多态性（ＲＦＬＰ）分析和核酸序列分析,并与已知植原体的序列进行同源性比较,构建进化树,结果显示该片段与Ｇｒ１的亲缘关系最近。     

长春花黄化植原体核糖体蛋白基因片段序列分析*

对自然表现典型黄化症的长春花植株总RNA进行植原体核糖体蛋白基因（ribosomal protein gene,rp gene）PCR扩增,得到约1.3kb的特异片段。将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定、限制性内切酶(EcoRI)酶切分析、核苷酸序列测定及分析,结果表明该株系核糖体蛋白基因片段长1,44bp,包含rp122、rps3基因,分别编码129和252个氨基酸,且这两个基因为重叠基因。该植原体核糖体蛋白基因特性与其它植原体相似。     

枣疯病植原体tuf和rp基因的克隆与序列分析

【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本研究旨在明确北京及河北地区枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病在亚组水平上分类提供一定的参考依据。【方法】利用植原体通用引物fTufu/rTufu和rp(v)F1A/rp(v)R1A对北京和河北地区枣疯病植原体延伸因子tuf基因和核糖体蛋白基因(rp)进行PCR扩增并进行核苷酸序列测定及相似性分析。【结果】获得北京地区JWB-XFSZ株系、JWB-XFDO株系以及河北地区JWB-TXSZ株系的tuf基因片段均为824 bp;北京地区JWB-XFSZ株系的rp基因片段为1196 bp。经序列相似性比较表明:tuf基因与16SrV组的葡萄黄叶病(Flavescence dorée)相似性最高,为92.84%,而与已经公布的其它地区(陕西杨凌)的枣疯病植原体tuf基因相似性较低,为57.29%;关于rp基因,北京地区枣疯病JWB-XFSZ株系与16SrV组的枣疯病泰山株系(JWB-Taishan)以及大麻丛枝病植原体(HFWB)相似性最高,均为99.83%,与16SrV组的成员相似性均在96%以上。【结论】北京与河北地区枣疯病植原体具有较高的相似性,而在tuf基因水平上,与陕西地区枣疯病植原体具有较大的差异;本研究中北京与河北两地区枣疯病植原体归属于16SrV组。     

长春花黄化植原体（PY）株系的检测与鉴定

植原体 (Ｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ) (原称类菌原体Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｌｉｋｅＯｒｇａｎｉｓｍ ,简称ＭＬＯ)是一类无细胞壁、存在于植物筛管细胞内的原核生物。植原体自 1 967年被日本学者土居养二首次发现后 ,迄今为止 ,世界上报道的植物植原体病害多达 30 0余种 ,早期对植原体的鉴定主要是通过生物学特性 ,如症状特征、与昆虫介体的相互关系等进行的。这些方法费时费力 ,结果往往也不是很可靠。 80年代 ,随着血清学、分子探针以及ＰＣＲ技术的发展应用 ,为植原体的检测提供了一种相对简单、灵敏、可靠的方法。通过对 1 6ＳｒＲＮＡ基…     

泰安枣疯病植原体的分子鉴定

【目的】对3个枣疯病病原物泰安株系进行分子鉴定。【方法】采用植原体通用引物对R16F2n/R16R2,通过直接PCR技术,扩增枣疯病植原体16S rDNA基因,通过16S rDNA基因序列分析和在线模拟16S rDNA-RFLP分析,并将其16S rDNA基因序列提交到GenBank数据库。【结果】3个枣疯病病原物16S rDNA基因片段与16SrⅤ-B亚组中枣疯病植原体(AB052876和AF279272)、樱桃致死黄化植原体(AY197659)及杏卷叶植原体(FJ572660)的同源性高达99.5%99.7%,分别命名为枣疯病植原体泰安圆铃1号株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Yuanling1,JWB-Yuanling1,TA)、枣疯病植原体泰安鲁北冬枣株系(Jujube witches’-broom phytoplasma strain Lubeidongzao,JWB-Lubeidongzao,TA)和枣疯病植原体泰安大白铃株系(Jujube witches’-broom phyto-plasma strain Dabailing,JWB-Dabailing,TA),基因登录号分别为:HM989946、HM989947和HM989948。【结论】3个枣疯病植原体泰安株系均归属于16SrⅤ-B亚组。     

甘薯丛枝病植原体的PCR检测

以报道的植原体 (Phytoplasma)16SrDNA基因保守序列为依据,设计合成了两对引物对R16mF2/ R16mR2和R16F2/ R16R2,以甘薯丛枝病（SPWB）带病植株的叶脉中提取的DNA为模板,应用聚合酶链式反应（PCR）技术和巢式PCR（Nested- PCR）技术对甘薯丛枝病病原进行分子检测。结果表明PCR扩增出了1.5　kb的特异片段,在PCR基础上的巢式PCR扩增出了1.2　kb的特异片段。灵敏度实验显示该方法所需PCR模板DNA量为0.1073　ng/μl,在PCR基础上的巢式PCR可以将灵敏度提高约10000倍,所需模板DNA仅为0.01073　pg/μl,在甘薯丛枝病的检测中是一种快速、灵敏、可靠的方法。     

大黄鱼16SrRNA和18SrRNA基因的测定与序列分析

利用多对引物,扩增并测定出大黄鱼16SrRNA基因和18SrRNA基因的部分序列,其长度分别为1202bp和1275bp,16SrRNA基因序列的GC含量为46．12％,18SrRNA基因的Gc含量为53．oo％。将大黄鱼16SrRNA基因序列与GenBank中15种硬骨鱼类的同源序列结合,同时将其18SrRNA基因序列与GenBank中9种脊索动物的同源序列相结合,运用软件获得各自序列间差异百分比,转换和颠换数值等信息。基于这两种基因序列,利用NJ法和BI法,分别构建16种硬骨鱼类和10种脊索动物的分子系统树。18SrRNA构建的系统树包括三大支,一支为哺乳类、鸟类和爬行类共6个物种,一支为两栖类的1个物种,另一支为2种硬骨鱼类。16SrRNA构建的系统树显示大黄鱼所在的石首鱼科与鲈科和盖刺鱼科亲缘关系较近。此外还讨论了这两个基因的序列特征。     

基于16S rRNA基因序列分析1例健康人龈上菌群

目的构建细菌16S rRNA基因文库分析健康人龈上菌群的组成。方法取1例健康成年女性龈上菌斑并构建细菌16S rRNA基因文库,分析其龈上菌群组成。结果 1例健康人龈上菌斑细菌的种水平分类有62种,其中可以培养的细菌有34种而尚无法培养的细菌有28种(45.1%);新发现的细菌物种有17种(27.4%);缓症链球菌是克隆子数最多的优势菌种;链球菌属、奈氏菌属和嗜血杆菌属占文库的60%,为主要菌群;构建的细菌16S rRNA基因文库的覆盖率为95%,文库的均匀度值为0.016。结论 1例健康人龈上菌群中45.1%的细菌尚无法分离培养、27.4%的物种尚不清楚,未培养菌及尚不清楚的菌种中可能藏匿着与口腔疾病密切相关的致病菌,全面地了解健康人龈上菌群的组成有助于研究龋病的发病机制。     

Effect of sample handling on estimation of bacterial diversity in marine sediments by 16S rRNA gene sequence analysis

Abstract The diversity of bacterial communities in deep marine sediments, up to 503 metres below the sea floor of the Japan Sea, was investigated by sequence analysis of amplified 16S rRNA genes. The use of different sample handling procedures greatly affected the types and diversity of sequences obtained. DNA from sediment samples stored aerobically for up to 24 h before freezing was dominated by sequences belonging to the β- and γ-proteobacteria, many of which appeared to originate from aerobic bacteria. Sub-samples equilibrated anaerobically at 16°C, were then injected with a radiotracer and immediately frozen, to simulate the conditions of a typical control sample from a radiotracer based activity assay, contained mostly α-proteobacterial sequences. Pristine sediment samples taken anaerobically and frozen within 2 h contained the widest diversity of sequences from α-, γ-, δ-proteobacteria and Gram-positive bacteria, which appeared to have originated from predominantly anaerobic or facultative bacteria. It was clear that both samples that were not frozen immediately (within 2 h) showed signs of enrichment of specific bacterial groups. Our results strongly suggest that immediate freezing should always be employed when sediment samples are to be used to assess bacterial diversity by molecular methods.     

利用小亚基核糖体RNA 技术分析温室黄瓜近根土壤古菌和真菌多样性

土壤古菌和真菌在温室生态系统是仅次于细菌的微生物,具有类似于细菌的重要生态功能。通过构建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文库,分析温室黄瓜近根土壤古菌和真菌群落结构组成,为开发利用温室这一特殊的生态环境中丰富的微生物资源以及理解微生物与植物间的互作提供参考依据。采用研磨-冻融-溶菌酶-蛋白酶K-SDS热处理以及CTAB处理等理化方法,提取和纯化微生物总DNA,构建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文库。利用DOTUR软件将古菌和真菌序列按照相似性97％的标准分成若干个可操作分类单元 (OTUs)。土壤古菌克隆文库主要包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并有少部分广域古菌类群,所有泉古菌均属于热变形菌纲,共45个OTUs;真菌克隆文库包括真菌门的大多数亚门真菌,共24个OTUs,未发现担子菌亚门真菌。古菌多样性比较丰富,且发现少量的广域古菌 (甲烷菌),这一情况可能与温室长期高温高湿,高有机质含量,土壤处于缺氧环境有关;土壤真菌的优势种群为子囊菌,占到土壤真菌的80％以上,这可能与绝大多数植物真菌性病害属于土传病害,通过菌丝体、菌核或子囊壳在土壤病残体中越冬有一定的关系。     

黄河三角洲盐碱地花生根层土壤菌群结构多样性

花生属豆科固氮作物,具较强的抗旱耐盐性,土壤微生物在盐碱土生态系统中具有重要的生态功能。以花生平作、花生/棉花间作为对象,通过16S rRNA基因克隆文库技术分析了黄河三角洲滨海盐碱地花生旺盛生长期不同含盐量盐碱地和非盐碱地0—40cm根层非培养土壤微生物群落组成及其多样性,分析了盐碱地花生根层土壤细菌群落与非盐碱地花生根层土壤细菌群落的差异,为揭示盐碱地花生根层土壤微生物的多样性以及土地利用变化与生态环境效应间的关系奠定基础。利用免培养技术直接从土壤样品提取总DNA,针对细菌基因组16S rRNA基因的V3高变区进行PCR扩增;利用焦磷酸测序的方法对V3高变区PCR产物进行高通量测序,并对测序数据进行生物信息学分析。结果表明,(1)黄河三角洲滨海盐碱土较高含盐量土壤中根层土壤微生物种类、优势种群数量和群落功能多样性较非盐碱土壤较为丰富。(2)盐碱土花生平作或花生//棉花间作两种种植方式基本不影响二者0—40cm根层土壤微生物优势类群;不同土壤类型和种植模式下,花生和棉花根层土壤中优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria) 4种菌群,其总丰度为80%—90%。非盐碱土壤中花生根层的酸杆菌门(Acidobacteria)丰度是盐碱土壤中的3倍以上,嗜热油菌纲(Thermoleophilia)和放线菌纲(Actinomycetales)丰度远高于各种盐碱土壤花生平作和花生//棉花间作两种植模式下的花生根层土壤;非盐碱土平作花生0—40cm土层中Rubellimicrobium、Pontibacter和Lamia细菌则显著缺失。(3)土壤类型对土壤微生物菌群类型影响较大,聚类分析表明,10个土壤样本依据土壤含盐量高低和根系分布深度聚为3类,即非盐碱土壤归为1类,盐碱土壤根系密集分布层0—20cm、20—40cm各归为1类。