APPswe基因慢病毒表达质粒的构建及对其SH-SY5Y细胞生长和凋亡的影响

为考察APPswe基因的表达对细胞生长和凋亡作用的影响,本研究采用gateway分子重组技术构建表达APPswe基因的慢病毒质粒,并将该质粒转染至SH-SY5Y细胞中.用RT-PCR和Western blot技术分别测定APPswe基因的mRNA转录和蛋白翻译水平.活细胞计数法和细胞外乳酸脱氢酶法分别测定细胞存活力和细胞膜损伤程度.Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测定细胞凋亡水平,Hoescht 33342染色观察细胞核形态变化,DCFH-DA染色法测定胞内活性氧水平.转录和翻译水平的验证表明,APPswe基因能够在SH-SY5Y细胞中相对稳定地表达.表达APPswe基因后,细胞的存活能力降低,损伤程度增加,细胞内活性氧水平上升,细胞核浓缩聚集,细胞发生凋亡反应.试验结果表明,APPswe基因的表达对SH-SY5Y细胞生长产生抑制作用,造成细胞损伤和凋亡,表达APPswe基因的SH-SY5Y细胞系可应用于体外AD病理发生机制和药物作用的研究.     

光遗传技术中的两种主要光敏蛋白及其在阿尔茨海默病研究中的应用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,但是,AD的发病机制还有待进一步的阐明。近年来,光遗传技术因其在时间和空间上的高精确性而逐渐被应用于AD的研究中。Ⅰ型光敏蛋白中的视紫红质通道蛋白-2 (channelrhodopsin-2, ChR2)和盐碱古菌嗜盐细菌视紫红质蛋白(Natronomonas halorhodopsin, NpHR)可以通过将光信号快速转换成跨膜离子电流来调节神经元的活动,因此,已经被应用于光遗传技术中。现对ChR2和NpHR在光遗传技术中的应用进行介绍,并总结其在AD研究中的应用进展。     

重组人FS315C末端蛋白表达及其抗体制备

构建FS315C末端肽原核表达载体pGEX-FS315C,表达重组人卵泡抑素315(FS315)C末端肽,制备抗FS315C末端抗体。实验结果显示,重组pGEX-FS315C表达质粒在E.coli BL21中高表达GST-FS315C融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化GST-FS315C免疫家兔,获得抗FS315C末端抗体,Western blot检测显示该抗体只与FS315结合,而与FS288无交叉反应。ELISA检测显示抗FS315C末端抗体与FS315特异结合,而与FS288、inhibin及activin A等蛋白均无交叉反应。利用该抗体进行的免疫组化染色显示巨噬细胞FS表达阳性,与以往报道一致。实验采用重组GST-FS315C免疫家兔,成功地制备了抗FS315C末端特异抗体。