三角帆蚌KuSPI基因的克隆及表达分析

Kuntiz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kuntiz-type serine proteinase inhibitor,KuSPI)又称胰腺胰蛋白酶抑制剂,能够和相应的蛋白酶互作来调控生物体内的级联反应。本研究通过RACE克隆得到三角帆蚌KuSPI cDNA全序列共624 bp,包含38 bp和148 bp的5'和3'端UTR,ORF(open reading frame)438 bp,编码氨基酸145个,分子量为16 397.5 u,KuSPI氨基酸序列的同源性分析后发现其包含1个典型Kuntiz结构域,属于典型的KuSPI基因。qRT-PCR检测表明:KuSPI基因在闭壳肌、外套膜、肠、斧足、肝、血液、鳃、性腺和肾脏中均有表达,在外套膜中最高。利用嗜水气单胞菌进行诱导后发现,KuSPI基因在外套膜中表达量变化最大,呈现明显的先升高再降低趋势。外套膜是三角帆蚌先天免疫的首道防线,我们推测Ku SPI基因在其免疫反应中起到重要作用。     

RNA干扰沉默三角帆蚌HcCA3基因对贝类矿化作用的影响

为探究三角帆蚌基质蛋白基因Hc CA3的功能,本研究根据Hc CA3基因的c DNA全长序列,设计并合成特定的干扰链(si RNA),将干扰链注射到三角帆蚌闭壳肌内,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测Hc CA3基因在外套膜不同部位即前端缘膜(amp)、后端缘膜(pmp)和中央膜(mc)的表达变化。在RNA干扰预实验中,筛选了三条目的基因干扰链,其中si RNA-Hc CA3-1干扰链干扰效果最好;同时筛选了4条阴性对照链,发现Hc CA3基因在注射不同的阴性对照链的各个组织中的表达均呈现不同程度的显著性下降,并没有筛选到合适的阴性对照链。在RNA干扰正式实验中,随着累计注射干扰链si RNA-Hc CA3-1,Hc CA3基因在前端缘膜和后端缘膜内出现了相似的表达特征,12 d出现了敲降作用(分别为对照组的28%和30%),Hc CA3基因在中央膜中表达从12 d开始显著下降(为对照组的84%),18 d为对照组的76%。本实验通过累积注射si RNAHc CA3-1,成功的抑制了Hc CA3基因在外套膜不同部位的表达,推测该基因参与了贝壳和珍珠的矿化,为进一步研究Hc CA3基因的功能提供了基础。     

三角帆蚌钙网蛋白基因cDNA的全长克隆与表达分析

采用同源克隆策略和RACE技术,从三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）外套膜组织中成功克隆得到钙网蛋白（Calreticulin,CRT）基因的全长cDNA序列,共1838 bp,开放阅读框为1257 bp,编码418个氨基酸,5'端非编码区为75 bp,3'端非编码区为506 bp,基因序列提交GenBank的登录号为JX416227。生物信息学分析表明,三角帆蚌钙网蛋白基因具有一段信号肽序列、两条典型的钙网蛋白家族标签序列KHEQNIDCGGGY和IMFGPDICG、三个保守的N-、P-和C-端功能域及内质网前导序列HDEL。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与海洋双壳类紧密聚在一起,且与蚯蚓等环节动物亲缘关系较近,聚为一支,然后依次与虾类、昆虫、鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。经荧光定量PCR检测,钙网蛋白基因在三角帆蚌的外套膜、闭壳肌、斧足、鳃、肝脏、性腺、心脏、肠等8个组织中均有表达,其中在外套膜、鳃和斧足等与贝类钙代谢相关的组织中表达量较高预示其可能参与三角帆蚌的钙代谢。不同Ca2+浓度处理试验的结果表明,随着水体中Ca2+浓度逐渐升高,三角帆蚌钙网蛋白基因在外套膜中的表达水平呈先上升后下降的趋势,并在60 mg/L时达 到最高峰,表明适宜的Ca2+浓度可促进钙网蛋白基因表达,而过高的Ca2+浓度则会抑制其表达。同时在60 mg/L Ca2+浓度条件下,对三角帆蚌外套膜进行不同时间的表达试验,结果表明钙网蛋白基因的表达量随时间推移先上升,并于48h达到最大表达量,而后逐渐下降。上述结果为进一步深入研究钙网蛋白基因的功能及其调控机理奠定基础。       

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸, ORF中含有一个S＿TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、內褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中, T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明, Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳...     

三角帆蚌BPI/LBP基因cDNA的分子特征及表达分析

杀菌通透性增加蛋白/脂多糖结合蛋白(bactericidal permeability-increasing protein/LPS-binding protein,BPI/LBP)在生物体的免疫应答过程中发挥着重要作用,但是在三角帆蚌中未见其相关的研究。我们采用RACE法获得三角帆蚌BPI/LBP基因c DNA全长(Gen Bank KX363568),该基因序列全长为1 793 bp,5'非编码区(untranslated region,UTR)和3'UTR分别为65 bp和219 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 509 bp,共编码氨基酸502个。氨基酸序列包括BPI1和BPI2两个结构域,同源性分析其与一些已知物种的BPI/LBP基因氨基酸发现各物种间具有相似的结构域,属于典型的BPI/LBP基因。q RT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析结果表明BPI/LBP基因表达于血液、肠、肾脏、外套膜、肝、腮、闭壳肌、性腺和斧足9个正常组织,表达量最高的是血液,最低的是肝脏。利用嗜水气单胞菌诱导后检测发现,血液、外套膜变化趋势最为明显,均呈现出先升高再降低的趋势,在3 h或12 h达到最大值,之后开始逐渐下降并趋于稳定,我们推测BPI/LBP基因在三角帆蚌的免疫反应中发挥着重要的作用。     

三角帆蚌精氨酸酶基因的cDNA克隆与组织表达分析

精氨酸酶(Arginase,Arg)是生物体尿素循环当中一种标志性的酶类,它不但与生物体许多疾病相关,而且是目前用于治疗肿瘤和癌症的一种重要的工具酶。根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术获得三角帆蚌精氨酸酶基因的全长cDNA序列。生物信息学方法分析表明精氨酸酶基因cDNA序列长1720 bp,开放阅读框(651072)1008 bp,编码335个氨基酸,5端非编码区为64 bp,3端非编码区为648 bp,软件推测其编码蛋白相对分子量为36.81 kD。研究采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法分析该基因在不同组织中的表达规律,结果表明,该基因在肝脏、胃、肠、鳃、心脏、外套膜、斧足共7个组织中都有表达,但主要集中在肝脏、胃和肠消化器官中表达。这可能说明低等的无脊椎动物三角帆蚌的精氨酸酶兼具有Ⅰ型和Ⅱ型精氨酸酶的特征和功能,既可以参与尿素循环,又可以在生理和病理过程中发挥重要作用,但还需进一步验证。       

三角帆蚌热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

对三角帆蚌HSP70基因序列进行全长克隆及其分子生物学分析,并检测其在不同水温刺激下鳃组织中的表达变化。通过高通量转录组测序获得三角帆蚌HSP70基因（HcHSP70）长片段,采用3'RACE对其进行了3'末端克隆,经拼接得到HcHSP70 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对HcHSP70 cDNA全长序列进行了特征分析,采用实时荧光定量PCR技术检测了其组织分布,并结合Western-blot技术检测蚌鳃中该基因mRNA与蛋白经不同水温刺激后的表达变化。结果显示,HcHSP70 cDNA全长为2298 bp,其中开放阅读框为1974 bp,编码657个氨基酸。预测分子量大小为71.6 Ku,pH7.0时的理论等电点为5.61。氨基酸序列分析表明,HcHSP70氨基酸序列含HSP70家族的3个标签序列（I₉DLGTTYS₁₆、I₁₉₇FDLGGGTFDVSIL₂₁₀和I₃₃₆ VLVGGSTRIPKVQK₃₅₀）,与长牡蛎及泥蚶的HSP70同源性最高（91%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HcHSP70在鳃、性腺、肝胰腺、外套膜及肌肉等5种被检组织中均有表达,以肝胰腺中的表达水平最高。实时荧光定量PCR与Western-blot技术检测皆表明,蚌鳃组织中HcHSP70基因与蛋白的表达量在37℃时达到最高,而在40℃水温刺激下表达水平下调至正常值,表明其在适应高温刺激时发挥了重要作用。     

三角帆蚌组织蛋白酶L基因的克隆和序列特征与进化分析

组织蛋白酶L在多种生理过程中具有重要作用.根据本实验室构建的三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)cDNA文库中已标注的EST序列,利用RACE方法克隆了三角帆蚌组织蛋白酶L基因的cDNA全序列(GenBank登录号为HQ610996).结果表明,该序列全长为1 105 bp,包括24 bp的5'-末端非转录区,1 002 bp的开放阅读框和79 bp的3'-末端非转录区,共编码333个氨基酸,包含1个由20个氨基酸组成的信号肽.推测的三角帆蚌组织蛋白酶L前体肽具有组织蛋白酶前体抑制因子功能结构域,具有组织蛋白酶L家族高度保守结构基序ERFNIN[E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]、GNFD和GCXGG;该蛋白的半胱氨酸类蛋白酶半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸活性位点均高度保守.同源性分析表明,推测的三角帆蚌组织蛋白酶L氨基酸序列与其他贝类高度保守,同源性在60%-74%之间.进化分析显示,三角帆蚌组织蛋白酶L与其他贝类组织蛋白酶L聚为一支,在该支中,三角帆蚌与软体动物淡水螺(R.peregra)的亲缘关系最近.本研究结果为进一步研究三角帆蚌组织蛋白酶L的生理功能提供基础资料.     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

几种淡水蚌外套膜蛋白质氨基酸组成及部分元素分析

测定了三角帆蚌、圆背角无齿蚌、褶纹冠蚌、背视丽蚌外套膜的粗蛋白含量 ,分析了外套膜干粉的氨基酸组成 ,并采用原子吸收光谱法和等离子吸收光谱法测定三角帆蚌、圆背角无齿蚌、褶纹冠蚌外套膜的 12种元素含量。结果表明 :干燥外套膜蛋白质含量为 :三角帆蚌 4 1 34% ,圆背角无齿蚌2 2 0 3% ,褶纹冠蚌 32 14 % ,背视丽蚌 7 78%。这四种淡水蚌外套膜均含有 17种氨基酸。被测的 12种元素中 ,Cu元素含量最高 ,其次是Fe ,Mn ,Mg ,Ca ,Zn ,Cr,而Ni,Co ,Pb ,Hg等元素含量较低。这四种淡水蚌外套膜是一类优质的动物蛋白质资源。     

池蝶蚌组织蛋白酶L基因的组织表达及免疫应激分析

应用cDNA文库筛查及同源片段克隆拼接技术,克隆了池蝶蚌组织蛋白酶L(Hs-CtsL)cDNA基因全长序列(GenBank注册号为JN604558)。其cDNA全长1152 bp,5′-非翻译区(Untranslated Region,UTR)长1 bp,3′-UTR长149 bp包括1个多聚腺苷信号AATAAA和Poly(A)尾巴,开放阅读框(Open reading frame ORF)为1002 bp,编码333个氨基酸组成的多肽链。其分子量约37.7 kD,理论等电点为7.16,包含信号肽、前体域和成熟域。系统进化分析显示,Hs-CtsL同无脊椎动物组织蛋白酶L聚为一支,且同三角帆蚌亲缘关系最近,其次为褶纹冠蚌。组织表达分析结果显示,池蝶蚌组织蛋白酶L在肠、鳃、性腺、外套膜、斧足、闭壳肌、血细胞、肝胰腺、肾和心脏均有表达,其中血细胞中表达量最高。应激实验表明,经嗜水气单胞菌刺激后,Hs-CtsL在血细胞、鳃、肝胰腺和外套膜中的表达量显著上调。其中在肝胰腺中刺激后6h表达量到达峰值,在血细胞、鳃和外套膜中的表达模式近似,表现为一个波动变化,在4h、12h和48h被上调。结果暗示着Hs-CtsL除参与了池蝶蚌血细胞的先天性免疫防御以外,还参与了其消化腺免疫器官的免疫应答反应。     

三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A (Cyclophilin A, CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp, 3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸, CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MO...     

三角帆蚌SOX2基因的分子鉴定及表达分析

SOX基因家族是一系列在性别分化、胚胎发育、细胞多功能性的维持等方面具有重要作用的转录因子,在高等脊椎动物中研究比较深入,但在淡水珍珠蚌中却很少见。本研究利用RACE法克隆获得了三角帆蚌SOX2基因的序列,其cDNA全长为1 840 bp,开放阅读框为672 bp,编码氨基酸223个。该基因具有SOX基因家族典型的HMG-box蛋白结构域,与其他物种对比发现,保守性极高。实时荧光定量PCR组织表达结果显示,在斧足中表达量最高,在肝脏中最低,同时发现雌雄性腺之间存在极显著性差异,雌性性腺表达量明显高于雄性性腺;性腺在早期胚胎中表达量明显高于其他时期,推测SOX2基因参与了三角帆蚌的性别分化和胚胎发育过程。     

马氏珠母贝TRA F7基因cDNA的克隆及表达分析

肿瘤坏死因子受体相关因子7(TRA F7)属于TRAFs家族,参与多种免疫炎症反应。为了研究马氏珠母贝TRAF7(PmTRA F7)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmTRA F7基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了马氏珠母贝不同组织中PmTRA F7基因mRNA的表达。结果显示,PmTRA F7基因cDNA全长2246bp,开放阅读框(ORF)1809bp,编码602个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长211bp,3'非翻译区(3'UTR)长226bp,预测分子量约为67.50kD,理论等电点为6.56。多序列比对结果发现软体动物间TRA F7具有高保守性。软件分析结果显示PmTRA F7的氨基酸序列具有典型的RING结构、锌指结构和7个重复的WD40序列。荧光定量数据分析表明,PmTRA F7基因在全组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,外套膜和鳃中表达量也较高。     

青蛤抗菌肽基因的克隆及其在组织间的表达分析

利用构建的SMART-cDNA文库及高通量测序方法,获得了青蛤抗菌肽macin家族相关基因(mytimacin)的全长序列,采用荧光定量PCR方法分析了mytimacin在青蛤各组织的表达情况,并在鳗弧菌胁迫下分析了mytima-cin在外套膜中的时序表达关系。结果表明,mytimacin基因全长461bp,开放阅读框为261bp,编码86个氨基酸,具有24个氨基酸的信号肽序列;荧光定量PCR结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中外套膜表达水平最高,在鳃中表达最低;在鳗弧菌刺激后6～24h,青蛤外套膜中mytimacin的表达量出现明显上调的趋势且与对照组差异显著(P<0.05),说明mytimacin抗菌肽基因在青蛤的免疫反应中具有重要作用。     

三角帆蚌热休克蛋白60基因克隆及其表达分析

利用3'RACE技术, 对高通量转录组测序所得三角帆蚌HSP60基因（hcHSP60）长片段（2629 bp）进行了3'末端克隆, 经拼接得到hcHSP60 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcHSP60 cDNA全长序列进行了特征分析, 并采用RT-PCR技术检测了其组织分布及经冷热应激后的表达变化。结果显示, hcHSP60 cDNA全长为2807 bp, 其中开放阅读框为1707 bp, 编码568个氨基酸, 预测分子量大小为61.04 ku, pH 7.0时的理论等电点为5.63。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明, hcHSP60氨基酸序列与光滑双脐螺HSP60同源性最高（达82%）, 而与牙鲆、白云金丝鱼HSP60的同源性最低（为75%）。RT-PCR检测结果表明, hcHSP60在肝胰腺中的表达水平最高, 而在血液中的表达水平最低。30℃与35℃水温处理三角帆蚌4h后, 各组织中hcHSP60表达水平明显上升, 表明hcHSP60可能在三角帆蚌耐热应激反应中起着重要作用。       

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低; HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。     

三角帆蚌alpha-2巨球蛋白活性测定及不同组织的表达

alpha-2巨球蛋白(alpha-2 Macroglobulin,α2M)是一种蛋白酶结合蛋白,是重要的天然免疫因子。利用α2M的作用原理,用三角帆蚌血浆保护胰蛋白酶,后用大豆蛋白酶抑制剂抑制未被保护的胰蛋白酶。利用Na-benzoyl-DL-arg-nine-p-nitroanilide(BAPNA)作为酶底物检测被保护的蛋白酶活性的方法,首次证明了三角帆蚌体内α2M的存在。在此基础上,克隆了α2M基因保守区受体结合区片段,进一步证明了α2M在三角帆蚌体内的存在。同时,还进行了α2M不同组织的表达检测,结果显示,α2M基因在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肠和性腺中没有表达。     

ARTP诱变对三角帆蚌外套膜细胞生长活性及其生物矿化相关因子的影响

为获取高活力的外套膜细胞, 研究通过常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP)诱变和流式细胞术等技术分析了不同诱变气量组(10、12和15 SLM组)和处理时间对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)体外培养的外套膜细胞的细胞活性及生物矿化相关功能的影响。结果表明: ARTP诱变360—900s能显著升高各组三角帆蚌外套膜细胞活力, 且在900s时达到最大值(P<0.05); 渗透压稳定剂的添加, 显著提高了诱变过程中12和15 SLM组在360—900s作用时间下的细胞活力(P<0.05), 其中12 SLM组外套膜细胞增殖指数显著上升至最大值(P<0.05); 诱变后细胞体外培养24h时结果显示, 12 SLM组720s的外套膜细胞活力显著达到最高(P<0.05); 15 SLM组(诱变时间为720s, 下同)SOD活力随着诱变气量的增大呈显著下降趋势, 且在15 SLM组显著降至最低水平(P<0.05), 相反, 微核率在15 SLM组达到最大值; 生物矿化分析表明, 外套膜细胞Ca2+的浓度、生物矿化相关的关键酶(碳酸酐酶、碱性磷酸酶)和钙调蛋白基因(Calmodulin, CAM)基因均在12 SLM组达到最大值(P<0.05), 而EFCB1(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1)基因结果显示在10 SLM组达到最大值(P<0.05), 12 SLM次之; 以上分析表明, 氦气诱变在气量为12 SLM, 处理720s时与渗透压稳定剂连用对外套膜细胞活性及其他生物学活性影响最为显著, 暗示氦气诱变可有效作用于外套膜细胞的离体培养, 为三角帆蚌建立细胞系提供生物学基础与新思路。