地鼠肾细胞培养的CTN株狂犬病新疫苗研究

应用细胞毒种代替豚鼠脑毒种制备狂犬病地鼠肾细胞纯化疫苗。将狂犬病毒CTN株在原代地鼠肾细胞（PHKC）传代适应,用病毒培养液上清作为生产用毒种,结果通过在PHKC传10多代,适应后病毒滴度达到了7.0LogLD50/ml,并应用适应株（CTN－LS－HK）细胞毒种制备三批疫苗,其效力在6.11-6.55IU/ml,高于用aG株豚鼠脑毒种制备的三批疫苗效力（3.77-5.85IU/ml)。     

流行性乙型脑炎病毒在Vero细胞上传代适应的研究

通过乙脑病毒Ｐ＿３株以不同方式在鼠脑和Ｖｃｒｏ细胞间传代适应的研究,培育出适于工业化大生产制备乙脑疫苗的生产毒种。其毒力可达７．０±０．５ｌｇＬＤ５０／０．０４ｍｌ,空斑滴度为７．５±０．５ＰＦＵ／ｍｌ,免疫原性ＩＤ５０值为０．００００１６－０．００００２３ｍｌ;在含有适量人白蛋白的１９９营养液内,该毒种于－３０℃至少可稳定一年;与鼠脑组织毒种相比,传代细胞毒种的毒力、免疫原性及稳定性均与其相当。然而,后者不含脑组织,至少降低了一种过敏的危险。另外,细胞毒种的制备无需手工解剖鼠脑,易于控制外源因子污染,易于标准化。对于大规模生产疫苗、提高疫苗产量和质量,传代细胞毒种比鼠脑组织悬液毒种具有明显的优点。     

Beagle狗肾细胞及用于制备乙脑活疫苗的研究

Ｂｅａｇｌｅ乳狗（５－１０日龄）肾块用热消化法制成细胞批放液氮保存,检定合格后做下列试验：（１）复苏培养长满单层后更换维持液,其细胞能维持４天以上,克服了常规消化培养细胞维持时间短（３６小时）的缺陷。（２）传代１４－２株病毒时,１代病毒的滴度即达６．０４－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ,１代后的各代（至１１代）病毒滴度无明显提高。（３）该细胞接种１４－２株病毒时不产生明显的破坏性病变（ＣＰＥ）,在收毒前采取冻溶１次比冻溶前的病毒滴度提高０．２７－０．５ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ。以ＢＤＫ细胞传１代的１４－２株病毒作生产毒种,收毒前冻溶１次等工艺法制备五批疫苗,全面检定结果均符合《乙脑活疫苗规程》的质量标准。其中病毒滴度为６．０９－６．２４ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ;免疫效价（ＩＤ５０＝ｍｌ）为１．９－４．０×１０－５,与相同滴度的原毒株１４－２ＰＨＫ苗对照无明显差异（ｔ＝０．９６８Ｐ＞０．０５）,表明其免疫原性与原毒株相似。     

从一名国内感染的艾滋病人分离人免疫缺陷病毒（HIV）

从一名国内感染的艾滋病人采血,分离其外周血单核细胞（ＰＭＣｓ）。首先与正常的ＰＭＣｓ共培养,４周后检测其ＨＩＶ－１ｐ２４抗原（ＥＬＩＳＡ）达到峰值。用此时的细胞及其上清分别感染Ｊｕｒｋａｔ－ｔａｔ、ＣＥＭ、ＭＴ４细胞,可很快地在这三株细胞中检测到ＨＩＶ生长,ＨＩＶ在Ｊｕｒｋａｔ－ｔａｔ细胞中生长情况最好,同时用病人血清直接感染Ｊｕｒｋａｔ－ｔａｔ和ＭＴ４细胞,４周后检测其细胞上清ＨＩＶ－１ｐ２４抗原（ＥＬＩＳＡ法）为阳性,但ＯＤ值很低（约为ＰＭＣ共培养组的一半）。用病人的少量全血与正常ＰＭＣｓ共培养,得到的结果与分离病人ＰＭＣｓ法相近。应用间接免疫荧光法（ＩＦＡ）、免疫酶法（ＩＥＡ）、蛋白印迹法及ＨＩＶ－１ＰＯｌ基因和Ｅｎｖ基因特异引物的聚合酶链反应（ＰＣＲ）等证实为ＨＩＶ－１病毒。分离的ＨＩＶ在Ｊｕｒｋａｔ－ｔａｔ细胞中连续传代,细胞被感染后２－３天即出现以大量融合细胞为主的细胞病变,感染后７－１０天细胞几乎全部死亡。病毒在连续传代过程中的生长特征及致细胞病变特征不变。此病毒命名为ＣＡ－２毒株。     

Egr-1基因调控序列连接OSM cDNA表达质粒的构建及其在黑色素瘤细胞中的表达

ＯＳＭ是一种对黑色素瘤细胞显示抑制作用的细胞因子．为进行ＯＳＭ针对黑色素瘤的基因－放射治疗研究,构建了小鼠Ｅｇｒ－１基因调控序列引导入ＯＳＭｃＤＮＡ真核表达质粒（ｐＥＯ）,ｐＥＯ质粒转染小鼠Ｂ－１６黑色素瘤细胞,经Ｇ４１８和抗人ＯＳＭ抗体的筛选,获得了稳定表达ＯＳＭ的克隆细胞（ｐＥＯ－１细胞）,ＯＳＭ表达量可达５．９７ｎｇ每１０５细胞天,分子量为３２ｋＤ．ｐＥＯ－１细胞用一定浓度Ｈ２Ｏ２处理后ＯＳＭ表达量可提高６２％,表明ｐＥＯ重组质粒可在氧自由基的刺激作用下增强ＯＳＭ表达     

HIV-1 SH01分离株在MT4细胞的超微结构特征和形态发生学研究

用外周血单个核细胞混合培养法分离到ＨＩＶ－１ ＳＨ０１株,具有典型的ＨＩＶ颗粒的形态学特征,核心颗粒呈锥形,可见芽生释放的全过程。偶尔可在胞装空泡内见到ＨＩＶ颗粒,同时还有细胞碎片和溶酶体结构,故此类空泡实际为ＨＩＶ吞噬泡。另一少见的现象是溶酶体摄取并消化ＨＩＶ颗粒,在ＨＩＶ－１ ＳＨ０１株感染７天或持续感染的ＭＴ４细胞中均可见到,后者尤为普遍。在ＨＩＶ－１ ＳＨ０１株持续感染的ＭＴ４转化细胞中,     

用CaG株毒种制备精制狂犬病疫苗的研究

通过对狂犬病毒aG株在金黄地鼠肾细胞上传代培养,获得一种新型狂犬病毒毒株,即地鼠肾细胞适应株(CaG株)[1].由于该毒种具有生产方法简单,成本低廉,且外源因子污染机率小等优点,因此试用该毒种生产精制狂犬病疫苗.在相同条件下,分别用豚鼠脑毒种和细胞毒种各生产3批病毒原液,经相同纯化工艺制备成精制狂犬病疫苗.经初步检定用细胞毒种制备的疫苗安全性良好,疫苗免疫效价与豚鼠脑毒种疫苗无明显差异.     

狂犬病毒在Vero细胞上的适应传代研究

我国目前用于预防狂犬病的疫苗主要是地鼠肾细胞狂犬病疫苗,由于其所用毒种是脑毒种,不仅容易导致外源因子污染,还会将脑组织成分带入疫苗。为了排除鼠脑毒种带来的外源因子污染,应用Vero细胞做基质生产液体毒种,可以得到理想的病毒滴度,而且免疫原性也较好。1材料与方法1．1材料1．1．1病毒株CTN－1V5由中国药品生物制品检定所提供。1．1．2细胞及其培养Vero细胞来源于ATCC,用常规方法培养。1．2方法1．2．1毒种的传代方法取CTN－1V5干燥毒种稀释后与Vero细胞混种于培养液中,用199培养液,33℃培养168h收获病毒液,如此连续…     

转基因小鼠用作脊髓灰质炎活疫苗神经毒力实验动物模型的研究

选用Ⅲ型脊髓灰质炎病毒,３批活疫苗样吕（ＷＨＯ／Ⅲ参考制品,９３／３６３和３Ｊ两批猴体神经毒力实验不合格的疫苗）和１株标准强毒株（Ｌｅｏｎ）,脊髓内注入携带有人细胞脊髓灰质炎病毒受体基因的转基因小鼠（ＰＶＲＴｇ２１）。临床和组织病理学检查表明,Ｌｅｏｎ病毒的毒力极强,２．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０可使１００％小鼠麻痹和死亡,ＷＨＯ／Ⅲ疫苗参考制品毒力最弱,５．５ｌｏｇ１０ＣＩＤ５０才能使８１．７％小     

二甲亚砜与维甲酸对人卵巢癌细胞COC1的生长抑制及转化生长因子β_1表达的影响

本实验以人卵巢癌细胞株（ＣＯＣ１）为模型,观察诱导分化剂二甲亚砜（ＤＭＳＯ）与维甲酸（ＲＡ）对该细胞生长增殖、ＤＮＡ合成和转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）在细胞内表达的影响。结果显示：ＤＭＳＯ与ＲＡ对人卵巢细胞ＣＯＣ１生长有明显的抑制作用,生长曲线表明作用５天后其生长抑制率分别为６２．７％和４２．１％;３Ｈ－胸腺嘧啶核苷（３Ｈ－ＴｄＲ）掺入实验说明ＤＭＳＯ组与ＲＡ组的单位时间计数率（ＣＰＭ）明显低于对照组（Ｐ＜０．０１）。用药３天后百分掺入抑制率分别为６０．４％与３７．９％,表明ＤＭＳＯ与ＲＡ抑制ＣＯＣ１细胞的ＤＮＡ合成;免疫细胞化学反应表明,ＤＭＳＯ或ＲＡ处理５天后,对照组细胞ＴＧＦβ１表达为阳性,定位于胞浆,而处理组细胞ＴＧＦβ１呈阴性或弱阳性反应。以上结果提示ＤＭＳＯ和ＲＡ对人卵巢癌细胞有一定的诱导分化作用。     

狂犬病毒aG株在Vero细胞上传代适应研究

为研制有效、安全和稳定的Vero细胞狂犬病疫苗提供实验室基础资料。采用狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上进行传代适应,同时对该毒株在Vero细胞上的增殖条件,病毒液的回收方法进行研究。结果显示,狂犬病固定毒4aG株在Vero细胞上多次传代后获得一株Vero细胞适应株(4aG-V株),该毒株的毒力可达8.50 logLD50/ml,且具有很好的抗原性及免疫原性。结果表明,感染Vero细胞最适种毒比例为1∶103,病毒滴度随着时间的延长而增强到第12天后逐渐减弱,且采用低温冻融破碎法回收的病毒液滴度优于直接收液法。4aG-V株在Vero细胞上维持时间长,可连续收液,有望其生产高滴度的狂犬病毒液。     

狂犬病病毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株的适应传代

目的建立狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在人二倍体细胞Walvax-2株上的传代适应株。方法用狂犬病病毒固定毒CTN-1V株经昆明小鼠鼠脑回传后的病毒接种Walvax-2细胞,连续传代,检测各代次病毒的滴度及免疫原性。结果 CTN-1V株能较好地适应Walvax-2细胞,通过连续带毒传代至第7代,病毒滴度可达6.78 lg LD50/mL,并在第10~15代内滴度维持在7.0 lg LD50/mL以上,15~30代滴度稳定在7.0 lg LD50/mL左右。以15代适应毒株CTN-1V-HDC P15制备的疫苗原液,各项指标均符合《中华人民共和国药典》三部(2010版)的要求,疫苗效力在6.0IU/剂以上。结论所获人胚肺二倍体细胞Walvax-2株传代适应狂犬病毒固定毒株CTN-1V-HDC可用于人用狂犬病疫苗的生产开发。     

肾综合征出血热病毒LR1株在Vero细胞上适应的特性研究

选取不同代次的ＬＲ１毒株在Ｖｅｒｏ细胞上传代适应,不同天数连续动态观察细胞病变情况,同时用免疫荧光法和ＥＬＩＳＡ进行抗原检测,收毒前细胞反复冻融及超声波破碎,细胞破碎前后用ＥＬＩＳＡ检测抗原含量,半微量空斑法检测病毒滴度。结果证明：ＬＲ１株病毒能在Ｖｅｒｏ细胞上产生细胞病变,病变程度与其毒力明显相关;ＬＲ１株病毒在Ｖｅｒｏ细胞上繁殖的最佳收毒时间为１１天左右;病毒释放性较差,冻融和超声波破碎细胞能明显提高其抗原含量和病毒滴度     

两种传代细胞系对轮状病毒D36株(P[4]G2)敏感性的比较

目的探讨轮状病毒D36株在MDCK细胞和Vero细胞上培养的适应性,确定其培养的最佳细胞基质及培养条件。方法将D36株以MOI 1.0按不同培养瓶分组接种MDCK细胞和Vero细胞,补充含有不同浓度胰酶的维持液,于不同时间观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对D36株的敏感性。结果D36株病毒感染MDCK细胞后第6天病毒滴度达到最高,为(5.00～5.50)lgCCID50/mL;而D36株病毒感染Vero细胞后病毒滴度于第8天达高峰,为(4.50～4.75)lgCCID50/mL。另外,在两种细胞维持液中加入约0.8μg/mL的胰酶均可提高病毒滴度。结论两种细胞系在同等条件下感染D36株病毒后,MDCK细胞比Vero细胞出现病变的时间早,每一批MDCK细胞培养物病毒滴度高于同批次试验的Vero细胞培养物。     

流感病毒在Vero细胞系与MDCK细胞系增殖条件的比较

目的研究流感病毒H1N1及其他亚型在Vero细胞系和MDCK细胞系高效增殖的最适条件,比较两种细胞系对流感病毒的敏感性差异及影响敏感性差异的条件。方法在培养好的Vero细胞系与MDCK细胞系用不同的病毒感染复数(M.O.I)、胰酶浓度、病毒吸附时间、病毒维持液血清质量浓度等条件进行流感病毒在细胞上的增殖。结果在M.O.I为0.01接种流感病毒,吸附时间为1 h,胰酶质量浓度2μg/mL,血清质量浓度为8%时,流感病毒血凝素在MDCK细胞系可获得较高的滴度。结论 MDCK细胞系是适于流感病毒培养的细胞,它作为生产新型流感病毒疫苗的主要细胞基质需要进一步的研究。     

人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及小鼠血清免疫学评价

目的: 研究人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及在实验小鼠中的免疫原性评价。方法: 轮状病毒ZTR-5株在MA104细胞上经蚀斑筛选纯化后,获得单一克隆接种至Vero细胞上适应性培养,免疫荧光定量检测病毒的感染性滴度,对收获的病毒液进行离心、超滤、分子筛纯化,甲醛灭活,抗原定量检测Al(OH)₃吸附制备的实验性疫苗。使用不同剂量(8EU、32EU、128EU、256EU)经肌内注射免疫小鼠,共免疫三次,免疫间隔2周。采用间接ELISA法检测血清特异性抗体效价。 结果: 通过蚀斑纯化,筛选得到一株纯化的病毒株ZTR-5纯-1,在Vero细胞上适应性后感染性滴度达7.35logCCID₅₀/ml;大量培养收获的病毒原液滴度为7.57logCCID₅₀/ml,制备获得轮状病毒样品抗原含量为2 560EU/ml;经肌内注射,初次免疫后,所有剂量组动物均获得抗体阳转,阳转率为100%;第一次加强免疫后,各组血清特异性抗体水平均明显增高,免疫剂量为128EU和256EU的两组小鼠血清抗体效价均达1∶10 240;第二次加强免疫后,各剂量组(8EU、32EU、128EU、256EU)血清抗体效价依次达1∶5 120,1∶7 456,1∶14 481.54,1∶14 481.54。 结论:人轮状病毒ZTR-5株可在Vero细胞上稳定增殖,所制备的疫苗具良好免疫原性,用128EU/2次免疫即可获得良好的免疫效果。     

应用细胞工厂建立人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺

目的为提高生产效率、增加原代地鼠肾细胞单产量及狂犬病病毒产量,建立人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）连续培养多次收获工艺。方法选用12-14日龄SPF地鼠,无菌取肾经消化,制备成细胞悬液,分装到40层细胞工厂并培养细胞成单层;接种狂犬病病毒固定毒aG株,连续培养病毒并多次收获。分别对同一细胞批制备的多个单次病毒收获液的免疫原性、病毒滴度和地鼠肾细胞蛋白质含量进行检测。结果用40层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和狂犬病病毒,细胞接种浓度为1．0×10。～1．5x10。cells／mL,（36±1）℃培养72h成致密单层;按0．1MOI病毒接种,可进行6次收获病毒;多个单次病毒收获液病毒滴度均不低于6．0lgLD50／mL;免疫原性检查保护指数不低于100;地鼠肾细胞蛋白质残留量随着收获次数的增加而不断降低。结论用细胞工厂建立了人用狂犬病疫苗连续培养多次收获工艺,能显著提高地鼠。肾单产量,增加产能。     

Alteration of the In Vitro Host Range of Rabies Virus after Serial Chick Embryo Cell Passage Using Alkaline Maintenance Medium

HEP Flury strain of rabies virus maintained by 7-day chicken egg passage (parent line) and the same strain serially passaged in primary chick embryo (CE) cells using alkaline maintenance medium (AM line) were inoculated to cells of various species. Growth was negative in primary mouse embryo, L and HeLa cells, and positive in primary hamster kidney and BHK21 cells with both lines. An all-or-none difference between the two lines was observed in primary monkey kidney and Vero cells. The parent line did not multiply in these monkey cells, whereas the AM line grew to high titers. In the case of Vero cells a unique cytopathic effect (CPE) was induced by the AM line. After five consecutive passages in Vero cells, the CPE-inducing agent was identified as rabies virus by a neutralization test. It was infective to intracerebrally inoculated suckling mice but not to adult mice, and its Vero cell-infective titer determined by CPE induction was about 1 log lower than the baby mouse-infective and CE plaque-forming titers. In contrast to the AM line, HEP Flury strain receiving 150 CE cell passages under neutral maintenance medium and three other strains receiving similar CE cell passages all failed to grow in Vero cells.     

Correction: Neutralizing Antibody Response after Intramuscular Purified Vero Cell Rabies Vaccination (PVRV) in Iranian Patients with Specific Medical Conditions

Objective

Post exposure prophylaxis using one of the WHO-approved vaccines is the method of choice for preventing rabies. Abnormal immune function in patients with some specific medical conditions, such as pregnancy, chronic hepatitis B virus infection, different types of cancers like lymphoma, diabetes I and II, corticosteroid consumption by patients with rheumatoid arthritis and lupus erythematosus, could impair the immunologic response to various vaccines. The immune response to rabies vaccination has never been examined in patients with any of these described medical conditions. This study purposed to evaluate the neutralyzing antibody response after vaccination with purified Vero cell rabies vaccine (PVRV) according to the WHO-recommended Post–Exposure Prophylaxis (PEP) "ESSEN" regimen.

Methods

Thirty healthy volunteers and 50 volunteers with different medical conditions who were exposed to a suspected rabid animal in the 2nd or 3rd category of exposure received 5 doses of PVRV under the ESSEN protocol. Three blood samples were collected on days 0 (before the first dose), 14, and 35. The anti-rabies antibody titer was measured using the Rapid Fluorescent Foci Inhibition Test (RFFIT) and an ELISA Bio-Rad, Platelia, Rabies II kit.

Results

All subjects reached NAb titers above 0.5 IU/ml by day 14 after vaccination. On day 35 (1 week after receiving the last rabies vaccine), anti-rabies antibodies were in the protective level (>0.5 IU/ml) in both groups. There was no statistically significant difference in anti-rabies antibody response due to the type of exposure (category 2 or 3), and successful seroconversion was confirmed in both groups.

Conclusion

In conclusion, the ESSEN protocol using the PVRV vaccine is sufficient for rabies prophylaxis in patients with specific medical conditions.