脑源性神经营养因子（BDNF）在成肌细胞中的稳定表达

将ｂｄｎｆ基因克隆入逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建得到ｐＬＮＣ／ＢＤＮＦ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染大鼠成肌细胞Ｌ６ＴＧ,Ｇ４１８筛选２周后,得到稳定表达ｂｄｎｆ基因的细胞克隆Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ。ＤＮＡ印迹结果证实ｂｄｎｆ基因已经整合入Ｌ６ＴＧ染色体中,ＲＮＡ印迹和斑点印迹结果分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白水平证明了ｂｄｎｆ基因的表达,且Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ培养上清中ＢＤＮＦ的含量约为２５ｎｇ（１０６细胞数每ｍｌ每２４ｈ）。     

大鼠酰胺化酶的信号肽引导的昆虫细胞表达外泌系统

将大鼠酰胺化酶的信号肽及前导肽编码序列引入昆虫核多角体病毒转移表达载体,构建ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）、ＰＡＢＣＩＧＦＩ融合基因的昆虫细胞分泌表达质粒ｐＢａｃＰＡＧ２、ｐＢａｃＰＡＩ,并与经修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组、筛选和鉴定,得到它们的重组病毒ＢａｃＰＡＧ、ＢａｃＰＡＩ。将重组病毒感染Ｓｆ２１细胞,ＰＡＢＣｈＧＲＦ（Ｇｌｙ）和ＰＡＢＣＩＧＦＩ均得到有效外泌表达,表达产物通过ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ柱可获得快速纯化。     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

绿色荧光蛋白基因在青蒿转基因芽中的表达

将改良的绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因,插入到植物表达载体中,构建双ＣａＭＶ３５Ｓ启动子驱动下的植物表达载体ｐＢＩＧＦＰ,在Ｋａｍ浓度为２０ｍｇ／Ｌ的筛选培养基上,用含有ｐＢＩＦＰ质粒的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４感染青蒿叶片,获得５个抗Ｋａｎ阳性丛生芽系。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析表明,外源ＧＦＰ基因已整合到青蒿转基因芽Ｇ－１系的基因组中。在ＯＬＹＭＰＵＳ－ＢＨ２型荧光显微镜下,观察到转基因     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

rhGM—CSF／LIF融合蛋白基因的克隆及表达

利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｓ的基因接头,将ＧＭ－ＣＳＦ和ＬＩＦ的ｃＤＮＡ相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体ｐＢＶ２２０后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹反应鉴定证实获得ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬＩＦ融合蛋白（简称ｒｈｇＭ－ＬＩＦ）活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

重组人肿瘤坏死因子α和白细胞介素6融合基因的构建和表达

本文利用ＰＣＲ技术和基因定位突变技术,将编码人肿瘤坏死因子α（ｈＴＮＦα）和白细胞介素６（ｈＩＬ－６）成熟肽的基因通过中间接头连接成编码单一蛋白的基因,构建了融合蛋白表达载体ｐＢＩＴ,并在大肠杆菌中得到了表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的电泳胶薄层扫描显示,融合蛋白的表达量是菌体总蛋白量的２０％,其分子量约为３７ｋＤ。活性检测证实,融合蛋白既有ＴＮＦ活性,又有ＩＬ－６活性。     

一个改进的PCR过程中聚合酶复制精确性测定系统的建立

在大肠杆菌中建立了一套用于测定ＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ过程中复制精确性的系统,并测定了耐热ＦＤＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ扩增过程中的复制精确性。这一系统主要包括以质粒ｐＵＣ１１８和ｐＵＣ１１９为出发质粒所构建的一套共６个突变质粒,分别为ｐＦＤＦＰ１１８和ｐＦＤＦＰ１１９（＋１移码突变）、ｐＦＤＦＭ１１８和ｐＦＤＦＭ１１９（－１移码突变）、ｐＦＤＦＵ１１８和ｐＦＤＦＵ１１９（碱基置换突变）。这些突变质粒均不能进行ｌａｃＺ－α互补反应,因此在含有Ｘ－Ｇａｌ和ＩＰＴＧ的培养基上菌落呈白色。同时还构建了ＰＣＲ产物克隆载体ｐＦＤＦＬ１１８和ｐＦＤＦＬ１１９。以上述突变质粒为模板进行ＰＣＲ反应,取反应产物和ｐＦＤＦＬ１１８或ｐＦＤＦＬ１１９连接后转化到大肠杆菌中。若在ＰＣＲ过程中发生回复突变,则转化子在含有Ｘ－Ｇａｌ和ＩＰＴＧ的培养基上呈蓝色。由转化子中蓝白菌落个数即可计算出ＤＮＡ聚合酶的复制差错率。用这一系统测得ＦＤＤＮＡ耐热聚合酶的复制差错率为１０－５～１０－６。     

豌豆凝集素和血红蛋白基因对水稻的转化和表达

为了扩大根瘤菌的突破产范围和试探根瘤菌在非豆科植物上的固所为作用,将豌豆凝集素基因（pl）和Parasponia andersonii血红蛋白基因 （phb）构建在同一个植物表达载体上,用基因枪法将其导入水稻（Oryza sativa L.ssp.japonica）。经PCR扩增和Southern杂匀分析,证明外源目的基因已整合到水稻基因组中。GUS组织化学染色及豌豆凝集素基因的Western印迹实验和表达产物的原位杂交,证实外源基因在转基因水稻中表达。在40个转化植株中18株有pl和phb基因的PCR产物,得率为45％。再用18株植物做pl基因的Western blot检测,有3株有翻译表达,占40株的7.5％,18株的17％。为水稻与根瘤菌的相互作用和固氮作用的可能性研究奠定了一定的基础。     

Transformation of Pea Lectin Gene and Parasponia Haemoglobin Gene into Rice and Their Expressions

Lectin and leghemoglobin in legumes play the important roles, respectively, in recognition of host plants to their rhizobial bacteria, and lowering the oxygen partial pressure around bacteroids and protecting nitrogenase from oxygen in symbiotic nitrogen-fixing nodules. In order to extend the host range of the rhizobial bacteria and to make them fix nitrogen in non-legumes, pea lectin gene ( pl ) and Parasponia hemoglobin gene ( phb ) have been constructed into a plant expression vector (pCBHUL) and the vector pCBHUL was introduced into rice calli from immature young embryos by particle bombardment. After the calli were regenerated into plantlets on the resistant-selecting media containing hygromycin, they were identified by PCR and Southern blot hybridization. It was indicated that the pl and phb genes were integrated into nucleic genome of the transformed rice plants. GUS activity and the product of the pl gene were determined by GUS staining, Western blot and in situ hybridization at translational level. Eighteen out of 40 plants resistant to hygromycin were positively identified by PCR analysis with the rate of 45%. The pl gene was expressed in 3 out of 18 plants with 17% and 7.5%in 40 plants. The results may provide a clue for exploring whether Rhizobium leguminosarum bv. viceae could extend its host range and make the transgenic rice plants have the possibility of being symbiotic, or associative to nitrogen fixation.     

脑胶质瘤组织中p16基因启动子区CpG岛甲基化检测及其临床意义研究

目的：研究脑胶质瘤中p16基因启动子区甲基化情况及其临床意义。方法：用甲基化特异性PCR技术检测42例脑胶质瘤组织和癌旁正常脑组织中p16基因启动子甲基化,并分析该基因启动子甲基化与临床病理特征之间的关系。结果：脑胶质瘤组织中p16基因异常甲基化率（38.27%）显著高于癌旁正常脑组织中p16基因的异常甲基化率（8.8%,P=0.000）。发生甲基化的肿瘤组织或者正常脑组织中p16基因mRNA和蛋白表达显著降低。此外,p16基因异常甲基化和肿瘤病理分级有相关性（P=0.007）,而与患者性别、年龄及肿瘤类型等临床特征无关（P=0.669,0.869和0.944）。结论：p16基因启动子区CpG岛高甲基化与p16表达下调相关,推测p16启动子区CpG岛高甲基化是导致p16基因在脑胶质瘤中表达下调的重要因素,有望成为脑胶质瘤早期辅助诊断的分子标志物之一。     

p150Sa12在人卵巢癌细胞株中促进MX1基因的表达

目的：研究p150Sa12在人卵巢癌细胞株中对MX1基因表达的影响。方法：将MX1基因的启动子克隆至带有Luciferase报告基因的pGL3-basic载体中,将其与p150Sa12表达载体用PEI介导的转染方法共转染至卵巢癌细胞株SKOV3,用双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性变化;将p150Sa12表达载体转染至卵巢癌细胞株ES-2,用western blot检测细胞中MX1基因的表达变化。结果：双荧光素酶检测系统检测MX1启动子活性被p150Sa12上调,westemblot检测转染p150Sa12后细胞中MX1表达量增加。结论：D150Sa12在人卵巢癌细胞株申促进MX1基因的表达。     

P16^INK4、Rb基因表达在肺癌发生中协调性研究

采用mRNA原位双杂交和免疫组织化学方法对31例非小细胞肺癌组织进行P16^INK、Rb基因、Rb基因表达水平及其相关性的研究。结果显示,以Dig-碱性磷酸酶－NBT／BCIP系统检测P16^INK4基因转录,阳性结果呈蓝色,阴性杂交率为22．6％（7／31）;以Bio－辣根过氧化物酶－AEC系统检测Rb基因转录,阳性结果为红色,阴性率为16．1％（5／31）。免疫组织化学检测显示P16^INK4蛋白质阴性率为42％（13／31）;Rb蛋白表达阴性率为19．4％（6／31）。Rb、P16^INK4基因在非小细胞肺癌发生中起协同调控作用,以P16^INK4基因表达异常为主。     

TA29-barnase基因转化甘蓝产生雄性不育植株

用PCR技术从烟草革新1号品种的总DNA中扩增了TA29基因的启动子和从解淀粉芽孢杆菌的总DNA中扩增了核糖核酸水解酶基因(barnse),将其构建成融合基因,并克隆于pCAMBIA2301载体上。通过根癌农杆茵介导转化甘蓝下胚轴,经Km选择压下连续选择、扩繁和进行生根培养,获得了甘蓝转基因植株。经GUS、PCR和Southernblot检测,证明TA29-bar-nase融合基因已经整合至转基因植株的染色体中。经花器官观察,转基因植株中有雄蕊退化的雄性不育和半不育植株出现。用正常花粉对不育株进行人工授粉,不育株能正常结实,这表明转基因不育植株的雌性器官发育正常,其不育性与TA29-barnse融合基因在转基因植株中的表达有关。     

两个紧密连锁的小麦苯丙氨酸解氨酶基因的分离与鉴定

利用一个小麦苯丙氨酸解氨酶基因PCR片段为探针,从小麦核DNA基因库中筛选出一个阳性噬菌体克隆,该克隆含有两个高度同源、紧密连锁、转录方向相同的小麦苯丙氨酸解氨酶基因PAL1与PAL2,它们之间的核酸序列同源性。为93％,相距约7kb,利用PAL1特异片段进行Southern分析,表明该基因在小麦基因组中具有多个拷贝。Northern杂交表明,经秆锈菌接种诱导,苯丙氨酸解氨酶基因在一对小麦抗-感近等基因系中差异表达：抗病等基因系中国春-Sr11携带与接种菌无毒性基因P11相对应的抗病基因Sr11,在接种4d后开始诱导表达,8d后表达量更高;而缺少抗病基因的感病系中国春-sr11接种6d后才开始表达,8d后的表达量与抗病系中6d时相当。用秆锈菌诱导物和几丁质寡聚物处理小麦悬浮细胞,均可在2h内激活苯丙氨酸解氨酶基因表达,但真菌诱导物在早期的诱导活性显著高于几丁质寡聚物。从转录水平证实了小麦苯丙氨酸解氨酶基因在秆锈菌诱导的抗性反应中具有重要作用。     

怀化医学高等专科学校医学形态学实验中心

目的:探讨抑癌基因p16对肝癌细胞生长的抑制作用及其机制。方法:将p16 cDNA亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,并经脂质体介导转染至人肝癌细胞株SMMC-7721。用MTT法和Western blot分析转染细胞的生长情况。结果:成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-p16,转染pcDNA3.1-p16的SMMC-7721细胞生长速度受到明显抑制;转染后有外源p16蛋白的表达,且伴随Bax上调,Bcl-2和cIAP2的下调。结论:重组pcDNA3.1-p16质粒能在人肝癌细胞SMMC-7721内表达,且能抑制SMMC-7721的生长,其机理与诱导肿瘤细胞凋亡相关。     

The Biolistic® PDS-1000/He device

This paper describes the design, operation, and performance of the Biolistic® PDS-1000/He device, which is used to transform living organisms with foreign DNA. DNA is delivered to cells in association with microscopic metal particles, called microcarriers, that are propelled at high velocity towards target tissues. The microcarriers are accelerated on a plastic cylinder, called a macrocarrier, which is driven by a shock wave of helium gas. The effectiveness of the PDS-1000/He device was tested by bombarding tobacco cell suspension cultures with microcarriers that were coated with plasmid DNA containing the B-glucuronidase (GUS) and neomycin phosphotransferase II (NPTII) genes. Two days after bombardment, there were 6835 ± 594 cell clusters per petri plate that expressed the GUS gene. Kanamycin resistant colonies were observed 6 to 8 weeks after bombardment, at a rate of 838 ± 134 colonies per bombarded plate.