猪瘟病毒弱毒株感染对体外培养细胞增殖的促进作用*

猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）能在多种体外培养细胞中增殖,却不使细胞产生病变（ＣＰＥ）。使用原代细胞增殖ＣＳＦＶ弱毒疫苗。结果显示：病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维持时间。因此,ＣＳＦＶ疫苗一产上能够在接毒后多次收获病毒。此外,ＣＳＦＶ弱毒株还能够刺激体外培养的兔巨噬细胞增殖,使形成致密的单细胞层。使用传代细胞ＰＫ１５样殖病毒,经流式细胞术检测发现ＣＳＦＶ弱毒的增殖不仅不改变ＰＫ１５细胞的增殖     

大鼠视网膜色素上皮细胞分离的改良及其MMP表达

目的探索和优化大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞分离培养的方法,评价RPE细胞的存活状态及细胞基质金属蛋白酶(MMP)的表达,为相关眼底疾病的研究提供细胞来源。方法采用改良的三步酶消化法分离大鼠RPE细胞,并进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,细胞生长曲线评价不同培养代数的RPE细胞的增殖活力。免疫荧光检测CRALBP和角蛋白表达鉴定RPE细胞,并观察不同培养代数RPE细胞中多种基质金属蛋白酶的表达。结果分离培养的RPE细胞可呈梭形、六角形,并维持RPE细胞特征性蛋白CRALBP和角蛋白表达,但细胞内色素成分随着细胞分裂和传代次数的增多逐渐减少。基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10在第1代和第3代RPE细胞中均表达阳性,且表达强度未见明显改变。结论应用改良的三步酶消化法可以成功的分离培养大鼠RPE细胞,并在第1代和第3代RPE细胞维持基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10的阳性表达。体外培养的大鼠RPE细胞为研究视网膜相关疾病提供了细胞模型。     

血小板来源的生长因子通过ERK/p38/PI3K促进人视网膜色素上皮细胞的增殖、迁移

目的:探讨血小板来源的生长因子(PDGF)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖和迁移的影响,并对参与其中的信号通路做初步研究.方法:体外培养的人视网膜色素上皮细胞与含有重组人血小板来源的生长因子的培养基(含有或不含2％(v/v)胎牛血清)共培养,用MTT法检测PDGF对RPE细胞增殖的影响,利用细胞爬片和免疫荧光技术检测PDGF对RPE细胞迁移等影响;另外分别向细胞培养物中添加PD98059,SB203580和PI3K等不同的信号通路分子抑制剂,判断参与PDGF激活的细胞活动相关的信号通路.结果:外源性PDGF能促进体外培养的人RPE的增殖和迁移.ERK1/2选择性抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002能显著的降低PDGF-BB诱导的人RPE细胞的增殖(P＜0.05),p38抑制剂SB203580没有明显的抑制作用.而对PDGF-BB诱导的RPE细胞的迁移,SB203580和LY294002有显著的抑制作用(P＜0.05),PD98059抑制作用不显著.结论:PDGF对RPE细胞的影响提示其在增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发展中有重要的作用,其可能为PVR提供一种新的毒副作用小的治疗手段.     

SPINK3促进体外培养的原代大鼠肝细胞增殖

肝病是威胁人类健康的主要疾病之一,而肝具有强大的再生能力,因此开发肝再生的药物靶标对肝病防治具有重大意义。本室前期采用大鼠全基因组芯片检测发现,丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型Ⅲ（serine protease inhibitor Kazal type Ⅲ, SPINK3）在大鼠肝再生中表达显著改变。研究表明,SPINK3是一类结构与表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)相似的生长因子,能够与表皮生长因子受体（EGFR）结合促进细胞增殖。本文通过基因过表达和干涉的方法处理原代大鼠肝细胞,通过CCK8法、Ki67免疫荧光法、PI单染法和Annexin V/PI双染法检测SPINK3表达变化对原代大鼠肝细胞活力、增殖、周期和凋亡的影响。结果显示SPINK3过表达时能够显著提高原代大鼠肝细胞的细胞活力,促进其细胞周期和增殖,并抑制其细胞凋亡,而干涉SPINK3表达则显著降低原代大鼠肝细胞的细胞活力,抑制其细胞周期和增殖,并促进其细胞凋亡。以上结果表明,SPINK3能够促进体外培养的原代大鼠肝细胞的增殖,并抑制其凋亡。     

猪原始生殖细胞生物学特性的研究

胚胎生殖细胞（embryonic germ cell,EGC）是由胎儿原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）经体外驯化培养获得的一种多潜能干细胞。研究猪PGC生物学特性对于建立猪EGC及了解猪生殖细胞发育机制具有重要意义。该研究以原代培养的猪PGC为对象,探讨了其生长行为特征及其重编程过程中多能性、生殖系标志基因的表达模式。结果显示,26 d胚胎生殖嵴分离的PGC呈碱性磷酸酶阳性,细胞体积及核质比较大;体外培养初期呈现出较强的增殖及迁移能力,培养第5 d细胞增殖达到平台期,此时克隆高表达Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc、Klf4和Ifi tm3（P〈0.05）,低表达Blimp1（P〈0.05）,Nanos1和Stella的表达水平与猪胎儿成纤维细胞无差异;猪PGC形成的原代克隆已经具有多向分化潜能。     

beta-catenin 基因在人骨肉瘤MG63 细胞系的表达变化

目的：观察分析beta-catenin 基因在人骨肉瘤MG63 细胞系的表达变化。方法：培养MG63 细胞株,用不同浓度的Wnt3a 蛋白或 相同浓度、不同时间段的Wnt3a 蛋白刺激液MG63细胞生长,用FQ-PCR在mRNA 水平检测beta-catenin 在MG63 细胞系的表达 变化。培养MG63 细胞株,用相同浓度的Wnt3a 蛋白刺激,比较刺激组与空白对照组的细胞数目的差别。结果：在细胞生长的第 0,1 天两组的MG63 细胞数量对比没有统计学差异（P＞0.05）;而在第2,3,4 天对照组细胞增殖速度较刺激组缓缓,经比较（t=4. 109,3.892,5.215,均P＜0.05）。beta-catenin 基因表达不会因为Wnt3a 的浓度增加而增加。100 ng/mL的Wnt3a 蛋白刺激beta-catenin 基 因表达最高,其他几个浓度的beta-catenin 基因表达对比没有统计学差异（P>0.05）。在100 ng/mL的Wnt3a蛋白刺激下,beta-catenin 基 因表达会随时间延长而增加,6 h时茁-catenin基因表达最高（P<0.05）,随后茁-catenin基因表达则没有统计学差异（P>0.005）。结 论：Wnt蛋白对MG63 细胞有正向增加增殖作用。激活Wnt/beta-catenin 信号通路能促进MG63 的细胞增殖。     

900 MHz手机辐射对人视网膜色素上皮细胞增殖活性及转化生长因子β2表达的影响

目的:研究900 MHz手机辐射对人视网膜色素上皮细胞(RPE)增殖活性及转化生长因子β2(TGF-β2)表达的影响。方法:采用体外培养的RPE细胞,给予900 MHz手机电磁辐射者处理作为辐射组,未给予辐射者作为对照组。通过CCK8法检测RPE细胞的增殖活性,Real-Time PCR法检测RPE细胞TGF-β2 m RNA的表达,ELISA法检测RPE细胞培养上清液中TGF-β2的蛋白含量。结果:与对照组相比,辐射组RPE细胞的增殖活性降低,TGF-β2 m RNA表达增加,RPE细胞培养上清中TGF-β2含量上调,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论:900 MHz的手机辐射可能能通过调节TGF-β2的表达和释放导致RPE细胞增殖活性降低相关的眼部疾病。     

川芎嗪对体外培养的胎鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨川芎嗪（TMP）在体外神经干细胞（NSCs）增殖与分化中的作用。方法：原代提取孕14 d雌性大鼠的胎鼠大脑皮层分离培养,并作免疫荧光染色鉴定,取传代培养第3代的NSCs进行实验。实验分为对照组、β-巯基乙醇阳性对照组、TMP诱导组和TMP+EGTA组（n=4）。采用BrdU法和MTT法观察川芎嗪对NSCs增殖数量的影响,采用蛋白免疫印迹法检测NSCs的分化表达情况。结果：实验成功分离纯化原代NSCs,培养3~5 d可见部分神经球形成,具备典型的NSCs形态并表达NSCs特异抗原巢蛋白;BrdU法和MTT法结果均显示,与对照组和β-巯基乙醇阳性对照组相比,TMP组NSCs增殖数量明显增多（P<0.05）;蛋白免疫印迹结果显示,TMP组和TMP+EGTA组NSCs的神经元分化率明显增高,TMP+EGTA组分化率增高更明显（P<0.05）。结论：TMP能显著增强NSCs的增殖和神经元分化率。减少细胞外Ca²⁺可促进TMP诱导NSCs向神经元分化,Ca²⁺信号在TMP诱导NSCs向神经元分化过程中起重要作用。     

以支持细胞为饲养层培养小鼠精原干细胞

为探索精原干细胞(Spermatogonialstemcells,SSCs)体外自增殖的条件以及SSCs体外快速扩增的方法,以6-8日龄昆明乳鼠为材料,分离小鼠睾丸细胞,采用Percoll梯度离心法富集SSCs;以经丝裂霉素C处理的Sertoli细胞作饲养层,以DMEM为基本培养基,加入5%胎牛血清和103u/ml的白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor,LIF),体外培养SSCs;运用免疫荧光技术,以SSCs特异性表面分子Thy1为标志,对原代培养20d和传代培养14d的细胞进行鉴定。该培养体系下,SSCs贴壁时间为6h-9h,48h后可见细胞分裂,迅速增殖出现在接种12d以后。接种后第20d形成数十至上百个细胞的细胞团,细胞总数比接种时增加了45-245倍,100倍显微镜下观察可见,单位视野内细胞团数为26±4个。传代后细胞增殖较快。原代培养20d和传代培养14d的细胞均为Thy1阳性;而传代20d后,细胞周缘不整,有伪足出现,呈现出死亡迹象。该培养条比较适合SSCs短期快速增殖。     

内皮素-1促进反应性星形胶质细胞增殖

目的利用成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型,探讨内皮素-1(ET1)与反应性星形胶质细胞增殖之间的关系。方法建立成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型,用100 n M ET1和5μM BQ788(内皮素受体B的拮抗剂)处理反应性星形胶质细胞48 h,通过免疫荧光的方法对各实验组中星形胶质细胞的标记分子Vimentin及Brdu进行检测,以确定ET1对反应性星形胶质细胞增殖的影响。结果 ET1组中星形胶质细胞的数量明显增加,Brdu阳性细胞占星形胶质细胞的平均百分比(19.41%)高于正常对照组(3.28%,P0.01);而ET1+BQ788组中Brdu阳性细胞数占星形胶质细胞的平均百分比为10.38%,明显低于ET1组(19.41%,P0.01)。结论在成年SD大鼠脊髓损伤原代培养的反应性星形胶质细胞模型中,ET1可刺激反应性星形胶质细胞的增殖,ET1受体endothelin B的拮抗剂BQ788可有效抑制ET1对反应性星形胶质细胞的促增殖效应。     

藏红花素对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响

目的：探讨藏红花素（crocin）对白血病患儿骨髓树突状细胞体外增殖作用的影响。方法：采用Ficoll-Hypaque法分离急性白血病患者骨髓液单个核细胞,将本实验分为六组。培养至第9天,在倒置显微镜下观察各组细胞形态,对各组细胞进行计数,并行瑞氏-姬姆萨染液染色,在油镜下观察典型树突状细胞的形态,应用流式细胞仪检测各组细胞免疫表型。结果：结果表明,实验各组均得到一定数量典型的DC,对照组中未见,实验各组细胞数目明显高于对照组,差异有显著统计学意义（P〈0.01）。在加入细胞因子的各组中,以E组即加入藏红花素1.25mg/ml组细胞数最高,而C组细胞数与D组细胞数比较无显著差异（P〉0.05）。培养至第9天,流式细胞仪免疫分析显示C、D、E、F各组CD1a＋、CD83＋、HLA-DR＋细胞比例明显高于A、B两组（P〈0.01）,差异有显著统计学意义,A、B两组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。D、F组与C组比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。E组与C、D、F组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：藏红花素能促进树突状细胞增殖,其促进树突状细胞增殖的能力明显弱于细胞因子的联合作用。藏红花素协同细胞因子促进树突状细胞的成熟具有浓度依赖性,在藏红花素浓度为1.25mg/ml时作用最强,而浓度过高或过低时均未表现出明显的促进作用。     

支架材料对棕色脂肪源性干细胞向起搏细胞诱导分化的影响

目的观察不同三维支架材料对棕色脂肪来源干细胞（BADSCs）诱导分化成起搏细胞的效果,为构建生物起搏器提供实验依据。 方法将培养7 d的原代BADSCs分别种植到胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶3种不同的材料中,在不同时间用光镜和扫描电镜观察细胞-支架复合体中细胞形态学的变化,免疫荧光染色检测心肌细胞、起搏细胞相关蛋白的表达。采用单因素方差分析。 结果细胞在3种支架上均能存活、增殖,LIVE/DEAD检测显示,培养3 d的胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶3种细胞-支架复合物死细胞率分别为（46.35±1.50）%、（47.00±1.60）%和（1.76±1.08）%,其中细胞在透明质酸水凝胶中死亡率最低,并且细胞-透明质酸水凝胶复合物可自发性地搏动,三组比较差异具有统计学意义（F = 37.56,P < 0.05）。培养至2周时,胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶中Connexin45细胞阳性率分别为（10.67±1.25）%、（13.67±1.25）%和（21.00±1.60）%,差异有统计学意义（F = 9.435,P < 0.01）,HCN2细胞阳性率分别为（11.00±1.60）%、（14.00±2.16）%和（34.33±3.68）%,差异有统计学意义（F = 17.52,P < 0.01）,HCN4细胞阳性率分别为（18.67±2.05）%、（13.00±1.60）%和（66.00±2.94）%,差异有统计学意义（F = 27.96,P < 0.01）,Sr细胞阳性率分别为（13.00±1.63）%、（14.33±1.24）%和（75.33±3.30）%,差异有统计学意义（F = 36.40,P < 0.01）,水凝胶中Connexin45、HCN2、HCN4和Sr的细胞阳性率均高于胶原海绵和明胶海绵,差异均具有统计学意义（P < 0.05）。 结论BADSCs在胶原海绵、明胶海绵和透明质酸水凝胶中均能很好地生长和分化,但透明质酸水凝胶更适用于组织工程化起搏器的构建。     

人早孕滋养细胞分泌趋化因子CXCL16促进自身增殖和侵袭

本文探讨趋化因子CXCL16在细胞滋养细胞的分泌特征,以及其促进滋养细胞增殖和侵袭的生物学作用。采用原代培养人早孕滋养细胞,ELISA法检测不同种植密度培养12、24、36、48、60、 72、100h上清液中CXCL16分泌水平;[3H]TdR掺入法分析外源性CXCL16刺激后滋养细胞的增殖效应;matrigel侵袭试验分析外源性CXCL16处理后滋养细胞的侵袭性。结果表明原代培养的人早孕滋养细胞可持续分泌趋化因子CXCL16,在最初培养的48h分泌旺盛,培养至100h仍可见CX- CL16分泌;rhCXCL16浓度达100ng/ml时能够明显促进体外培养的滋养细胞增殖效应:rhCXCL16 浓度达10ng/ml时能明显促进滋养细胞的侵袭能力。实验证明人早孕滋养细胞分泌趋化因子CX- CL16,并以自分泌方式促进滋养细胞的增殖和侵袭,可能在胎盘形成和绒毛外滋养细胞的入侵中发挥重要作用。     

模拟微重力条件下对WB-F344肝干细胞表征分子表达的影响

研究大鼠WB-F344肝干细胞在旋转式细胞培养系统（RCCS）中培养进行细胞大规模扩增并保持干细胞的特性的可能性,为干细胞治疗疾病及肝组织工程提供理想的细胞来源。以WB-F344肝干细胞在RCCS中培养,以平面单层培养为对照,在培养后不同时间分别进行形态观察、流式细胞仪测细胞周期、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测肝干细胞特异性基因甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（ALB）的表达, 免疫荧光染色检测 AFP、ALB蛋白的表达。结果表明,RCCS培养的WB-F344细胞粘附在Cytodex-3微载体上状态生长良好,细胞增殖较平面培养有明显增加;RT-PCR和免疫荧光染色检测结果一致：模拟微重力培养组AFP的mRNA表达强度及AFP阳性细胞均显著高于平面培养组,而ALB mRNA表达强度和ALB阳性细胞均低于对照组。说明模拟微重力 培养条件下,能较好的维持肝干细胞特性,进一步证明我们建立的这种培养体系是成功的,是一种理想的肝干细胞培养模式。     

重组人肝细胞生成素的生物学性能

利用ＭＴＳ及３ＨＴｄＲ掺入法,首次观察了重组人肝细胞生成素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｎ,ｒｈＨＰＯ）在体外对原代培养大鼠肝细胞及肝癌细胞增殖的正向调控作用。结果表明ｒｈＨＰＯ是一种重要的肝细胞增殖刺激因子,可望成为临床治疗肝病的新药物。同时也观察到ｒｈＨＰＯ可以在体外抑制肺癌细胞ＤＮＡ的合成,为探究其作用机理提供了有益的提示。     

低氧对胚胎干细胞增殖的影响

目的:观察间歇性低氧和持续性低氧对体外培养的胚胎干细胞(ES细胞)增殖的影响.方法:利用细胞记数法和BrdU (5-溴脱氧尿苷)掺入的流式细胞分析检测细胞增殖,并用RT -PCR的方法检测低氧诱导因子(HIF-1a)的表达变化.结果:①将ES细胞分别放在低氧(3%～10% O2)和常氧(20% O2)的环境中培养24 h后,在低氧环境中培养的ES细胞数较常氧组明显减少;②将ES细胞分别给予间歇性低氧刺激(3%～10% O2),每天10 min,连续4 d后,发现3%低氧组较常氧对照组的细胞增殖明显升高.③用RT-PCR方法观察HIF-1a的表达与细胞增殖的关系,发现在常氧环境中培养的ES即有HIF-1a的表达,ES细胞在持续低氧24 h或间歇性低氧(3%～10% O2)刺激4 d后对HIF-1a的表达均无明显影响.结论:间歇性低氧(3% O2)可明显促进体外培养的ES细胞增殖,而持续性低氧抑制ES细胞增殖,间歇性低氧(3% O2)刺激促进ES细胞增殖的机制尚有待于进一步的研究.     

牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养

分别用胶原酶Ⅲ和胰蛋白酶成功地分离了牛胎儿成纤维细胞,并对其进行了体外培养,同时探讨了两种酶消化分离牛胎儿组织的时间对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。用组织块直接培养也成功得到了牛胎儿成纤维细胞,并探讨了不同组织块大小对牛胎儿成纤维细胞原代培养的影响。通过绘制生长曲线,可以研究牛胎儿成纤维细胞增殖规律;通过制备牛胎儿成纤维细胞的细胞染色体发现,经过传代(12代)、冷冻保存、解冻,牛胎儿成纤维细胞染色体数目不变。     

中风膏对氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠海马神经干细胞增殖的影响

目的：研究中风膏对体外氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠神经干细胞增殖的影响。方法：采用悬浮培养法分离纯化新生SD大鼠大脑海马神经干细胞,免疫荧光法鉴定细胞,第3代贴壁培养神经干细胞氧糖剥夺2 h后,复氧培养24 h造模。实验分为正常对照组、模型组、中风膏5%含药血清组、中风膏10%含药血清组、中风膏20%含药血清组,每组6个复孔,分1 d、3 d、5 d、7 d 4个时间点。CCK8法检测细胞活力,流式细胞仪测定细胞凋亡。结果：悬浮培养细胞均高表达巢蛋白（nestin）。在增殖试验中,正常组与模型对照组比较,模型对照组的细胞增殖能力明显降低（P<0.01）;与模型对照组相比,第3日,中风膏20%治疗组的细胞增殖能力明显增强（P<0.01）;实验第5日、7日,中风膏5%、10%、20%组细胞增殖能力明显增强（P<0.01）。在凋亡实验中,与正常组比较,模型对照组的细胞凋亡明显升高（P<0.01）;与模型对照组相比,中风膏20%组细胞凋亡显著下降（P<0.01）。结论：中风膏含药血清对海马神经干细胞OGD/R损伤后的增殖能力有显著的修复作用,20%中风膏含药血清对干细胞损伤有治疗作用,可降低细胞凋亡。     

北京油鸡肺间充质干细胞的分离培养及鉴定

以9-14日龄北京油鸡肺脏组织为材料,Ⅳ型胶原酶消化,percoll分离,获得肺间充质干细胞.进行免疫组化和RT-PCR鉴定,并比较3种培养体系对北京油鸡肺间充质干细胞增殖的影响.RT-PCR结果显示,细胞免疫组化签定结果CD44、CD29呈阳性,CD34呈阴性.证实所培养的细胞为北京油鸡肺间充质干细胞;比较不同扩增培养体系,结果表明,培养体系DMEM/F 12+10％FBS+2.5 ng/mL bFGF较有利于北京油鸡肺间充质干细胞的增殖.该试验成功地分离并鉴定了北京油鸡骨骼肌卫星细胞,建立了适于北京油鸡肺间充质干细胞体外扩增的培养体系.     

白细胞介素对大鼠离体垂体前叶细胞增殖的影响

本工作采用大鼠垂体前叶（ＡＰ）细胞原代培养方法,以３ＨＴｄＲ掺入率反映细胞增殖水平,研究了ＩＬ１和ＩＬ６对ＡＰ细胞增殖的影响。结果表明：（１）ＩＬ１（１－１００ｎｇ／ｍｌ）促进雄性大鼠和雌性大鼠ＡＰ细胞的增殖。（２）低浓度的ＩＬ６（０．１ｎｇ／ｍｌ）抑制雄性大鼠的ＡＰ细胞的增殖,而较高浓度的ＩＬ６（１－１０ｎｇ／ｍｌ）则表现为刺激作用。（３）ＩＬ６（０．１－１０ｎｇ／ｍｌ）促进雌性大鼠ＡＰ细胞的增殖。上述结果说明ＩＬ１和ＩＬ６除直接调控ＡＰ细胞的分泌外,也参与调节ＡＰ细胞增殖活动。