狂犬病毒糖蛋白的克隆表达及其在中和抗体检测中的应用

目的:制备基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原,并评价其在疫苗免疫后中和抗体检测中的应用价值。方法:TRIzol法从狂犬病疫苗中提取总RNA,经RT-PCR获得糖蛋白目的基因片段,构建相应的原核表达质粒,转化大肠杆菌HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,以重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测糖蛋白中和抗体的ELISA方法。结果:获得狂犬病毒糖蛋白优势表位区段抗原,建立了糖蛋白中和抗体ELISA检测方法。该检测方法对59例健康献血员血浆样本检测特异性为98.31%(58/59),接种狂犬疫苗免疫个体血浆样本抗体阳性率为98.95%(94/95)。结论:基因工程表达的狂犬病毒糖蛋白优势表位抗原可用于人接种狂犬疫苗后疫苗免疫效果评价。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法研究

目的：建立重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法。方法：取重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)以1：10比例加入lmol/L盐酸调节pH值,采用ELISA双抗体夹心法检测,同时设以氢氧化铝、未处理的重组乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、出血热疫苗,以及试剂盒的阴、阳性作为对照。结果：狂犬疫苗、出血热疫苗及氢氧化铝对照为阴性,直接检测重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)呈弱阳性,加入盐酸调节pH值后原倍样品呈弱阳性,10倍稀释后呈强阳性。采用该方法检测5批疫苗均呈强阳性。组内平行试验,组间重复试验。结论：将重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)调节pH值后10倍稀释,用ELISA双抗体夹心法检测呈阳性,而且稳定可靠,该方法可用于该疫苗的鉴别试验。     

表达PEDV S和PoRV VP7蛋白的重组伪狂犬毒株构建

【背景】猪流行性腹泻、猪轮状病毒病与猪伪狂犬病是严重危害全球养猪业的3种重要传染病,混合感染往往导致猪场更严重的损失。【目的】利用同源重组技术构建共表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S蛋白和猪轮状病毒(Rotavirus,PoRV) VP7蛋白的猪伪狂犬三联基因工程疫苗株,并研究其部分生物学特性。【方法】通过序列比对、蛋白结构分析筛选s基因的475?804 aa和vp7基因的17?339 aa作为毒株构建的目的片段,依次构建了pMD-S、pMD-VP7、pMD-VP7.S克隆载体和pEGFP-VP7.S转移载体。将质粒pEGFP-VP7.S和PRV XJ亲本株同源重组,空斑纯化得到重组毒株PRV (CM),对其稳定性和增殖特性进行研究。【结果】构建了共表达S蛋白和VP7蛋白的伪狂犬基因工程病毒,连续传代20次,均能检测到vp7和s基因,而gE基因阴性;Western blotting证实2种外源基因在重组病毒中均能实现良好的表达;测定亲本毒株和重组毒株的TCID50分别是10?7.59/0.1 mL和10?7.25/0.1 mL。【结论】获得了伪狂犬基因工程重组弱毒株PRV (CM),外源基因稳定存在,毒力基因稳定缺失,增殖特性差异不大,为PRV、PEDV和PoRV基因工程三联苗研究奠定了基础。     

狂犬病活载体疫苗研究进展

狂犬病是急性直接接触性人兽共患病,症状凶险,一旦发病,必死无疑,当被带有病毒动物咬伤后,可用疫苗接种产生自动免疫防止发病。为此,在狂犬病研究中,对狂犬疫苗,特别是狂犬病毒基因工程疫苗的研究一直是最活跃的领域。利用重组 DNA 技术开发的狂犬病重组活载体疫苗已有制品,这是近十     

C3d-M28增强伪狂犬病毒gC基因体液免疫

研究补体C3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gC基因DNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gC基因串联后,克隆到载体pcDNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgC-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgC-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gC蛋白的重组质粒(sgC)免疫组产生的ELISA抗体高17倍,对致死剂量(316LD50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gC基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平,显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。     

融合Th细胞表位序列Myostatin重组基因疫苗的构建及其对免疫动物肌肉力量的影响

目的:本实验利用基因重组技术,构建融合Th细胞TT830-844表位序列的人重组Myostatin基因疫苗真核表达载体pVAC-TT-Ms,检测该基因疫苗对免疫小鼠前肢抓力的影响,为后续以Myostatin作为靶分子来改善废用性肌肉萎缩等病症的研究提供实验基础。方法:化学耦联方法合成Myostatin C-末端成熟肽(330 bp)基因序列及其N-端融合TT表位序列的DNA片段,重组质粒pVAC-TT-Ms的构建、纯化及瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)按该类研究中的常规实验操作,并检测重组基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫小鼠骨骼肌前肢抓力的变化。结果:酶切和测序结果表明,重组Myostatin基因疫苗表达载体pVAC-TT-Ms构建成功。重组质粒pVAC-TT-Ms OD260/280比值和电泳结果显示,该质粒作为基因疫苗符合免疫动物的质量要求。细胞荧光免疫检测结果表明,瞬时转染的CHO细胞中目的蛋白明显表达。动物免疫实验初步证明,重组Myostatin基因疫苗可显著提高免疫小鼠的前肢抓力,与正常对照组比较,免疫小鼠前肢抓力平均增加了29.88%。结论:本实验成功构建了在真核细胞中能有效表达融合TT表位序列人重组Myostatin基因疫苗表达载体,初步证明了重组Myostatin基因疫苗可显著增加免疫小鼠前肢抓力。     

表达新冠病毒S基因重组狂犬病病毒的构建及其免疫原性

【背景】新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)在全球流行已近3年,除对人类造成了巨大伤害,也影响了人类的伴侣动物。人的COVID-19疫苗已在全球应用,但动物用的新冠病毒疫苗却鲜有报道。【目的】研制兽用新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)和狂犬病病毒(rabies virus,RABV)的二联苗。【方法】将合成的SARS-CoV-2 S基因和S1基因分别克隆至RABV弱毒疫苗株rHEP-Flury基因组G与L基因间,并将2个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,拯救重组病毒rHEP-nCOV-S和rHEP-nCOV-S1。通过RT-PCR、Western blotting和荧光抗体染色,验证重组病毒、确证S和S1蛋白在RABV中成功表达。再将重组病毒接种NA细胞及成年小白鼠,测定病毒的体外生长特性、重组病毒的致病性及免疫原性。【结果】免疫荧光结果显示,转染7d后细胞上清均出现了绿色免疫荧光,表明已成功拯救嵌合SARS-CoV-2S和S1基因的重组病毒RABV rHEP-nCOV-S和rHEP-nCOV-S1,并且rHEP-nCOV-S1的增殖和扩散能力强于亲本株rHEP-Flury,但rHEP-nCOV-S与亲本株无显著差异。Western blotting结果显示,在目的位置处均出现72kDa和144kDa特异性条带,表明S和S1蛋白在重组RABV中高效表达。重组病毒免疫6周KM小鼠后,小鼠的体重变化与亲本RABV基本一致,重组病毒诱导小鼠产生狂犬中和抗体。【结论】本研究拯救出了嵌合SARS-CoV-2 S/S1基因的重组RABV,为动物COVID-19载体疫苗的研发奠定了基础。     

扎伊尔型埃博拉重组糖蛋白GP-Fc基因疫苗构建及免疫原性研究

本实验将基于埃博拉病毒表面糖蛋白抗原GP基因序列,按照哺乳动物密码子使用频率优化,并与人IgG恒定区构建融合蛋白GP-Fc基因序列,重组蛋白序列插入基因疫苗载体pVR中,构建重组蛋白基因疫苗pVRmodGP-Fc。通过基因疫苗导入系统免疫小鼠,用间接ELISA和间接免疫荧光对抗体效价进行评估。实验结果显示,重组蛋白GP-Fc的基因疫苗可以很好的刺激小鼠产生特异性抗体,免疫周期结束后,小鼠血清中结合效价终点达到高剂量组1∶300 000及低剂量组1∶180 000,同时血清中的抗体可以很好地结合表达GP抗原的细胞表面,表现出很强的荧光信号。通过该研究我们验证重组蛋白基因疫苗pVR-modGP-Fc可以很好地诱导BALB/c小鼠产生较高滴度的抗原特异性IgG,具有较好的免疫原性。     

利用细菌人工染色体技术构建整合F基因的重组MDV疫苗株*

目的:预防马立克氏病病毒(MDV)和新城疫病毒(NDV)混合感染鸡引起的疾病,构建表达NDV F蛋白的MDV疫苗株CVI988 BAC重组载体,并包装成重组病毒,为疫苗免疫提供更多的重组疫苗选择。方法:首先利用PCR扩增带有卡那霉素(Kanamycin,Kana)抗性基因片段的F基因,采用同源重组的方法将其整合到CVI988 BAC上,进一步诱导I-SceI表达敲除Kana基因而获得重组质粒CVI988 BAC-F。通过磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞获得重组病毒。结果:Western blot和间接免疫荧光实验证实重组病毒能够表达F蛋白。病毒生长曲线和蚀斑大小测定结果表明,F基因的插入不影响病毒的体外增殖。结论:利用BAC技术成功构建了整合F基因的重组MDV病毒CVI988 BAC-F,为MDV重组疫苗研发,防控NDV与MDV共感染奠定了基础。     

狂犬疫苗的研究进展

全球每年由狂犬病毒引起的死亡人数为50 000例,狂犬病毒严重威胁着人类的健康。目前狂犬疫苗是抵御狂犬病毒的最有效的手段,随着近些年生物技术的不断发展,人类对新型疫苗的研制取得了显著的成果,安全有效的人用狂犬疫苗的出现,为人类抵御狂犬病毒提供了更有效的保护。细胞培养的狂犬疫苗还将是当前和未来一段时间人类抵御狂犬病毒主要手段,而单克隆狂犬病毒免疫球蛋白药物不久的上市,将为人类抵御狂犬病毒提供更安全有效的治疗。     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒aG株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRGΔCKRN。采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间。经核酸及蛋白水平检测表明VTKRGΔCKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性。重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱。VTKRGΔCKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击。以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体。非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRGΔCKRN免疫效果好、更具安全性。     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病.HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍.目前虽然基因重组HBV表面抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要能诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,本文构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较了这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化.     

卡介苗载体及其在疫苗研究中的应用

卡介苗是发展多价疫苗最好的载体之一.把外源基因导入卡介苗有3种途径:一是分枝杆菌噬菌体衍生的基因转移系统;二是分枝杆菌质粒衍生的基因转移系统;三是同源重组基因转移系统.重组卡介苗多价疫苗的研制为各种疾病的预防开辟了广阔的前景.     

重组疫苗预防乙型肝炎

自1982年Paoletti和Moss以及他们的同事们开始研究疫苗重组体的应用以来,用带其它免疫基因的疫苗病毒来达到免疫目的的想法似乎很吸引人,理论上,当把活病毒用到动物时,将表达一个插入到它的DNA上的外源基因。随后对该外源基因产物产生免疫性反应。到目前为止,重组DNA技术已成功地表达了多种疫苗抗源,包括乙型肝炎表     

重组鸡白细胞增多病疫苗获得认可

北里研究所宣布于94年5～6月进行基因重组鸡白细胞增多(leukocyto-zone)疫苗的野外试验。11月22日北里研究所为了作为治疗药制造基因重组鸡白细胞增多病疫苗,得到认可(适应指导方针)。 日本的鸡白细胞增多病是住血孢子虫类(目)Haemosporidia的Leucocytozoidae科的原虫Leucocytozooncaulleryi感染而致。针对原虫的基因重组动物用疫苗确认适合指导方针还是首次。     

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒Ag株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKRN.采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间.经核酸及蛋白水平检测表明VTKRG△CKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性.重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱.VTKRG△CKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击.以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体.非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRG△CKRN免疫效果好、更具安全性.     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

汉坦病毒核酸疫苗在小鼠体内表达分布的初步研究

运用生物荧光技术,肌肉免疫接种小鼠含汉坦病毒S抗原基因片段的核酸疫苗,观察重组核酸疫苗在其体内的表达分布。进一步探讨汉坦病毒核酸疫苗的应用前景。扩增纯化已构建好的含有汉坦病毒S抗原基因片段和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pEGFP/S;免疫接种小鼠胫前肌,观察pEGFP/S在小鼠体内的表达分布。免疫接种3 d后在实验组小鼠肝、肾、脾、肌肉各组织均检测到较强的绿色荧光。重组质粒pEGFP/S能在小鼠的多个组织器官表达,为深入研究汉坦病毒核蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。     

乙肝病毒DNA疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

构建含adr亚型HBV表面抗原基因的核酸疫苗 ,考察人白细胞介素II基因及重组白细胞介素II的免疫佐剂作用。用含有人白细胞介素II基因的真核表达质粒及基因重组白细胞介素II蛋白作为佐剂 ,将编码乙型肝炎病毒表面抗原的重组真核表达质粒 pVAX/HBS免疫BALB/C小鼠 (试验组 ) ,同时设置注射质粒pVAX的阴性对照组 ,并分别于第 2 ,4周后加强免疫各 1次。试验组在第 4周时开始有HBsAb产生 ,阴性对照组未测到HbsAb ,试验组和对照组均未检测到HBsAg。乙肝病毒DNA疫苗能引起小鼠特异性体液免疫应答 ,白细胞介素II的真核表达质粒的佐剂作用不明显 ,基因重组白细胞介素II蛋白具有提高小鼠对乙肝病毒核酸疫苗免疫应答水平的佐剂活性。     

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。