分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗免疫原性及其抗血清中和hCG生物学活性的作用

本文观察分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白避孕疫苗体液免疫效力的能力。采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ,在CHO 细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ+弗氏佐剂和单用hCGβ免疫生育期雌性BALB/c 小鼠,共免疫两次,间隔4周。ELISA 测定血清中抗hCGβ抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清中和hCG 生物学活性的能力进行比较。结果表明hCGβ单独免疫组在加强免疫后才见抗体生成,其抗体滴度比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组低1995倍,C3d3的佐剂能力是弗氏佐剂的10倍(初次免疫)-32倍(再次免疫),并且hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的中和hCG 生物学活性的作用。实验证明通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGβ的体液免疫应答能力。     

分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白疫苗免疫原性及其抗血清中和hCG生物学活性的作用

本文观察分子佐剂C3d3增强hCGβ蛋白避孕疫苗体液免疫效力的能力。采用分子生物学技术以phCMV1为载体分别构建分泌型、带有6个组氨酸纯化标签的真核表达质粒phCMV1-6His-hCGβ-C3d3和phCMV1-6His-hCGβ,在CHO细胞中获得重组蛋白的稳定、高效表达,并用镍柱和凝胶过滤层析对其进行分离、纯化。分别用hCGβ-C3d3融合蛋白、hCGβ 弗氏佐剂和单用hCGβ免疫生育期雌性BALB／c小鼠,共免疫两次,间隔4周。ELISA测定血清中抗hCGβ抗体滴度,并对各组小鼠产生的抗血清中和hCG生物学活性的能力进行比较。结果表明hCGβ单独免疫组在加强免疫后才见抗体生成,其抗体滴度比hCGβ-C3d3融合蛋白免疫组低1995倍,C3d3的佐剂能力是弗氏佐剂的10倍(初次免疫)-32倍(再次免疫),并且hCGβ-C3d3融合蛋白免疫小鼠产生的抗血清具有很强的中和hCG生物学活性的作用。实验证明通过分子佐剂C3d3可以大幅提高机体对hCGβ的体液免疫应答能力。     

hCGβ真核表达载体的构建和瞬时表达筛选

为探讨人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）基因避孕疫苗的可能性,利用DNA重组技术将hCGβ的基因片段连接到真核表达载体pCMV4上,酶切分析鉴定正确构建了质粒DNApCMV4-hCGβ,将质粒DNApCMV4-hCGβ通过脂质体转染的方法导入体外培养的Hela细胞,双抗夹心ELISA法检测质粒DNApCMV4-hCGβ在Hela细胞瞬时表达系统中特异性的表达了hCGβ。结果表明hCGβ表达含量24h为6.78ng/ml,48h为15.24ng/ml,说明在体外瞬时表达了特异性hCGβ的pCMV4-hCGβ真核表达载体能够作为DNA疫苗使用,为pCMV4-hCGβ质粒DNA免疫小鼠进行DNA避孕疫苗的研究奠定了基础。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基和补体C3d片段组成的单链多肽的生物合成

利用PCR方法在hCGβcDNA 3’端产生一个Bam HI酶切位点,将此cDNA克隆入pBS HindⅢ和Bam HI位点之间。用T3、T7引物从正反两个方向同时测序,确证其序列正确性。将C3d3 cDNA从pSG5·PSG5·C3d3·YL·C3d3·YL切出与hCGβ串联构建成质粒pBS-hCGβ-C3d3。然后构建表达载体pVL1393-hCGβ-C3d3,并与线性化核型多角体杆状病毒(AcNPV)基因组DNA共转染昆虫细胞Sf9,以噬斑法筛选出重组病毒AcNPV-hCGβ-C3d3。以重组病毒AcNPV-hCGp-C3d3转染Sf9细胞,收集的条件培液经检测,确定其具有远远高于hCGβ-oLHα的结合活性。经hCGβ单抗亲和层析柱分离纯化后,以SDSPAGE和Western blot均证实了表达产物的存在,分子量与预期的hCGβ-C3d3一致,并具有hCGβ的免疫学活性。     

分子佐剂C3d增强草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗的免疫应答

为增强免疫不育的效果,探讨分子佐剂C3d对草原兔尾鼠透明带3(LaguruslagurusZonaPellucida3,LZP3)基因免疫的调节作用。构建了含3个拷贝C3d的lzp3基因真核细胞表达质粒pcDNA3-LZP3-C3d3(pcD-LC),以不含C3d的质粒pcDNA3-LZP3(pcD-L)为对照,体外转染HeLa细胞,RT-PCR和Westernblot分别检测到lzp3mRNA和蛋白的表达。对NIH雌性小鼠肌肉进行基因免疫注射,ELISA结果表明pcD-LC免疫诱导的特异性抗LZP3-IgG水平明显高于pcD-L对照组(P<0.05),且有长期免疫应答效应;MTT结果显示pcD-LC能够诱导淋巴细胞增殖活性的提高。抗生育实验表明pcD-LC免疫组显著降低窝产仔数(P<0.05),且卵巢切片正常。研究结果证实C3d能够增强lzp3DNA疫苗的特异性免疫应答并达到抗生育效果,为DNA疫苗控制草原兔尾鼠的深入研究提供了基础。     

流感裂解疫苗H3N2-抗H3N2免疫原性复合物滴鼻诱导小鼠黏膜免疫应答的研究

目的研究流感裂解病毒疫苗抗原抗体复合物滴鼻诱生小鼠黏膜免疫应答.方法分别以15μg H3N2、H3N2-CpG、H3N2-鼠抗H3N2及H3N2-PEG滴鼻免疫小鼠,检测肺泡灌洗液抗H3N2 IgA、血清抗H3N2 IgG效价.取免疫小鼠脾细胞,体外抗原刺激,用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液IFN-γ及IL-4分泌水平.结果H3N2-抗H3N2免疫原性复合物诱生的抗H3N2 IgA效价明显高于H3N2单独免疫组(P＜0.01),而与H3N2-CpG组无显著性差异.此外,复合物诱生的血清抗H3N2也高于H3N2单独免疫组(P＜0.05).H3N2-CpG组诱生的IFN-γ水平明显升高,而其他组之间无明显差异.结论流感病毒血凝素抗原抗体复合物、血凝素抗原加CpG佐剂可以诱生较强的局部黏膜免疫和体液免疫.这两组诱生的IgA效价均明显高于H3N2单独免疫组.另外,H3N2-CpG组小鼠的脾脏细胞经特异性抗原诱导后培养上清液中的IFN-γ水平明显升高.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基DNA疫苗的构建及其抗肿瘤作用的初步研究

人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCGβ)除了在正常的妊娠滋养层细胞中分泌外,在许多肿瘤细胞也大量分泌,是防治hCGβ依赖型癌症的有效目标分子之一.通过RT-PCR方法克隆全长的hCGβ基因,成功构建了PCR3.1-hCGβ DNA疫苗,其能够在HeLa细胞中高效表达hCGβ蛋白,表达的hCGβ蛋白主要存在于细胞内.将20 μg PCR3.1-hCGβ质粒DNA通过普鲁卡因盐酸盐(bupivacaine-HCl)药物诱导后接种小鼠肌肉,小鼠能够吸收质粒DNA,并表达编码的hCGβ蛋白抗原,表达的hCGβ被小鼠的免疫系统识别,同时激发hCGβ抗原特异性的体液免疫和细胞免疫反应,抗体滴度最高可超过1∶8000,并且这两种类型的免疫应答均能够在体外作用于HeLa细胞, 诱导其发生细胞凋亡,表明PCR3.1-hCGβ DNA疫苗激发的免疫反应在体外具有抗肿瘤作用.     

单克隆非特异性抑制因子-β(MNSFβ)在大肠杆菌中的表达、抗体的制备及在小鼠子宫内膜上的组织定位

为了获得足够量的单克隆非特异性抑制因子-β蛋白(monoclonal nonspecific supressor factor β,MNSFβ)及其抗体用于探讨MNSFβ在着床中的作用机理,本研究构建了表达质粒pBV220/MNSFβ-hCGβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白MNSFβ-hCGβ,用抗hCGβ抗体对表达产物进行鉴定,结果表明融合蛋白MNSFβ-hCGβ得到了正确表达,且分子量和理论值相近。表达产物MNSFβ-hCGβ经初步纯化后用于免疫Balb/C小鼠,制备抗体。同时,我们还构建了表达质粒pGEX-4T-2/MNSFβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白GST-MNSFβ。用融合蛋白GST-MNSFβ对融合前的免疫小鼠回忆刺激并进行检测,制备了抗MNSFβ多克隆抗体和单克隆抗体。应用所制备的多克隆抗体进行免疫组化研究,对MNSFβ在小鼠子宫内膜上进行了组织定位,结果显示,MNSFβ在着床日(受精后第4.5天)小鼠子宫非着床位点的表达和着床位点相比明显提高。     

猴Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆及其在大肠杆菌中表达

Fertilin是一种异二聚体精子表面蛋白.业已证明,它在精卵反应中起着重要作用.成熟的Fertilinβ亚基的氨基端93肽含有与整联蛋白结合的整联蛋白配体区.该整联蛋白配体区与蛇毒整联蛋白配体区高度同源,它们能与细胞表面的整联蛋白相结合.在此我们报道猴成熟Fertilinβ氨基端93肽基因的克隆和在大肠杆菌中的表达.用RT-PCR方法获得mmFβNTP93基因,克隆入表达载体pT7-7/hCGβ的EcoRI和BamHI位点,该基因与hCGβ基因一起表达融合蛋白mFβNTP93-hCGβ,Western blotting结果显示,融合蛋白的表观分子量为33kDa,能与抗hCG抗体专一性结合.由于mFβNTP93基因与hCGβ基因相连,因此我们推测,mFβNTP93基因已获得表达.     

抗整合素β3胞外区噬菌体抗体库的构建及筛选

用RT-PCR的方法从人胶质瘤BT-325细胞中扩增人整合素β3胞外区,并克隆到载体pET-24a中构建表达载体.表达的人整合素β3胞外区经变性、复性和纯化后免疫BALB/c小鼠,提取脾脏总RNA,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,经重叠PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接成单链抗体(scFv)基因,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化至大肠杆菌TGl,经辅助噬菌体M13KO7超感染,构建噬菌体单链抗体库.通过淘选从该抗体库中筛选特异性识别人整合素β3胞外区的噬菌体单链抗体.结果表明,成功构建了库容为2.6×106的抗人整合素β3胞外区的单链抗体库,初步筛选到了与人整合素β3胞外区特异性结合的单链抗体.     

单克隆非特异性抑制因子—β（MNSFβ）在大肠杆菌中的表达、抗体的制备及在小鼠子宫内膜上的组织定位

为了获得足够量的单克隆非特异性抑制因子-β蛋白（monoclonal nonspecific supressor factorβ,MNSFβ）及其抗体用于探讨MNSFβ在着床中的作用机理,本研究构建了表达质粒pBV220/MNSFβ-hCCβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白MNSFβ-hCCβ,用抗hCGβ抗体对表达产物进行鉴定,结果表明融合蛋白MNSFβ-hCGβ得到了正确表达,且分子量和理论值相近,表达产物MNSFβ-hCGβ经初步纯化后用于免疫Balb/C小鼠,制备抗体,同时,我们还构建了表达质粒pGEX-4T-2/MNSFβ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白GST-MNSFβ,用融合蛋白GST-MNSFβ对融合前的免疫小鼠回忆刺激并进行检测,制备了抗MNSFβ多克隆抗体和单克隆抗体,应用所制备的多克隆抗体进行免疫组化研究,对MNSFβ在小鼠子宫内膜上进行了组织定位,结果显示,MNSFβ在着床日（受精后第4.5天）小鼠子宫非着床位点的表达和着床位点相比明显提高。     

IL-5在非复制重组痘苗病毒中的表达及其对重组病毒免疫效果的影响

利用非复制型痘苗病毒表达载体 pNEOCK11β75IL5和重组病毒RVJ12 3,通过两步重组构建了能同时表达IL 5和乙型肝炎病毒HBsAg的非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3Δ11β75IL5。Southern blot证实 ,痘苗病毒C K片段间基因缺失的同时伴有IL 5基因的插入。鼻腔吸入分别免疫Balb/c小鼠和新西兰白兔 ,ELISPOT实验证实 ,免疫后两周小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgA抗体分泌细胞 (ASC)数比对照组 (RVJ12 3Δ11β75 )增加约 2倍 ,而同时小鼠肺淋巴细胞的抗HBsAgIgG抗体分泌细胞 (ASC)数与对照组无差别。可在小鼠血液、肺浸出液以及新西兰白兔血液、肺浸出液、其它分泌液样品中检测到抗乙型肝炎病毒HBsAg的特异性的IgA、IgG抗体 ,与对照组相比 ,IgA抗体阳转率及抗体滴度提高 ,而IgG则无差异。本实验说明 :IL 5可在体内选择性地增强机体的粘膜IgA反应。提示非复制载体疫苗中 ,表达的该细胞因子可有效的增强疫苗的粘膜免疫反应 ,为粘膜疫苗的发展策略提供了新的途径     

人绒毛膜促性腺激素β亚基和绵羊垂体促性腺激素共有α亚基组成的单链多肽的生物合成

采用重叠PCR方法,将人绒毛膜促性腺激素β亚基(hCGβ)cDNA3'端与绵羊垂体促性腺激素共有α亚基(oLHα)cDNA 5'端串联起来,构建了hCGβ-oLHα嵌合cDNA。将嵌合cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)表达载体pVL1393得到表达型质粒pVL1393-hCGβ-oLHα,并与BaculoGold~(TM)线性化AcNPV基因组DNA共转染昆虫细胞Sf9,筛选得到重组病毒AcNPV-hCGβ-oLHα。以扩增后的重组病毒感染昆虫细胞进行表达,并进一步经偶联抗hCGβ单抗亲和层析柱纯化得到hCGβ-oLHα单链多肽。SDS-PAGE银染和免疫印迹分析结果表明表达产物在非还原条件下表观分子量约40.5kD,还原条件下约为38.0kD,这说明表达产物具有链内二硫链及次级构象。竞争抑制~(125)I-hCGβ与抗体结合的检测结果表明其与hCGβ抗体结合活性较天然hCG弱,但较天然hCGβ略有增加。由此可见单链多肽作为抗hCG夏合抗原避孕疫苗的靶抗原,具有潜在的应用前景。     

Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力的影响

为研究Snail基因修饰对骨髓间充质干细胞(MSCs)CXCR4表达水平及向SDF-1趋化能力影响, 将重组真核表达载体(pCAGGSneo-snail-HA)及对照空质粒(pCAGGSneo)转染MSCs, 采用免疫荧光细胞化学染色、荧光标记流式细胞仪技术及RT-PCR检测细胞CXCR4表达水平; 体外跨膜趋化实验评价MSCs向SDF-1趋化能力, 观察抗CXCR4中和抗体的干预作用。MSCs-Sna的CXCR4表达水平明显高于MSCs-neo。MSCs-Sna在SDF-1诱导下细胞迁移量较MSCs-neo显著增加(P<0.05)。抗CXCR4中和抗体可显著减少SDF-1a诱导的MSCs-Sna趋化运动。研究提示通过上调Snail表达而提高MSCs向正调节表达SDF-1的受损组织迁移效率的可行性, 为优化MSCs迁移力的研究提供了实验基础。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化

作为开发新型实用性人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的一种尝试, 我们已构建若干组合靶抗原三个线性B- 细胞表位和外源强T- 细胞表位的基因工程hCG嵌合肽。为了检测用这些嵌合肽免疫的动物血清中是否能产生抗各表位的三种抗体,本研究选用能在大肠杆菌中高表达和与生物素亲和性强且特异(方便通过亲和层析纯化)的链霉亲和素为载体,分别构建了三种含β-hCG不同单一线性B_细胞表位(β5,β9和β8)的融合蛋白。在链霉亲和素基因下游多克隆区EcoRⅠ和Hind Ⅲ位点插入各表位编码基因片段(带TAA终止密码子)的pTSA-18重组质粒, 转化BL21(DE3)pLysS宿主菌后, 它们在IPTG诱导下均能以较高水平表达各自目的融合蛋白,而且它们的表达产物在Western blot鉴定中都能被抗各表位特异的多抗或单抗或抗报告表位单抗识别。用改良的制备性PAGE方法可以一步纯化电泳均一性高于95%的三个融合蛋白, 它们的收得率相对1L培养物约为5 mg。作为化学合成表位肽的替代物, β-hCG三个单一B- 细胞表位融合蛋白的可获得性将有助于所构建hCG基因工程嵌合肽以及其他hCG疫苗,也包括它的DNA疫苗的免疫原性分析。     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的小鼠免疫应答研究

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段双表达核酸疫苗,并观察其免疫原性。方法 分别将HBcAg、FL基因克隆入pJW4303载体,获得双表达核酸疫苗,体外转染293T细胞检测目的基因的表达。分组免疫BABL／c小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗-HBc IgG效价,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测HBcAg特异性Th1／Th2型细胞因子的分泌水平。结果 所构建疫苗在体外均能表达HBcAg和FL,当基因位于内部核糖体切入位点(IRES)元件上游时表达水平明显较优。pJW4303／C／FL免疫组产生的抗-HBc IgG效价和Th1／Th2型细胞因子的分泌水平均显著优于pJW4303／C和pJW4303／FL／C组。结论 成功构建双表达核酸疫苗,基因位于上游时表达水平高于下游。FL基因的引入明显增强了HBcAg核酸疫苗的免疫原性。     

白癜风患儿抗核抗体、免疫球蛋白及补体检测的临床分析

目的:探讨白癜风患儿中抗核抗体(ANA)、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)以及补体(C3、C4)的表达及临床意义。方法:收集2014年10月至2016年5月我院收治的30例白癜风患儿为病例组,并于同期随机选取30例健康体检儿童为对照组,患儿的血清ANA、12种自身抗体谱分别采用间接免疫荧光法及免疫印迹法进行检测,IgG、IgA、IgM,C3、C4水平采用免疫透射比浊法进行检测。结果:病例组中ANA阳性率为13.33%(4/30),与对照组的3.33%(1/30)比较,差异无统计学意义(P0.05)。12种自身抗体谱中,分别有1例(3.33%)患儿dsDNA、SmDNA、SS-A/Ro60KD、SS-B/La、CENP-B阳性,与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。病例组患儿血清IgG、IgA、C4水平低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。ANA阳性患儿血清IgG、IgA、IgM水平高于ANA阴性患儿,而补体C3、C4水平低于ANA阴性患儿,差异有统计学意义(P0.05)。结论:白癜风患儿ANA阳性表达与健康儿童无明显区别,体液免疫功能有明显异常,临床有重要的参考价值。     

C3d-M28增强伪狂犬病毒gC基因体液免疫

研究补体C3d的受体结合功能区(M28)对伪狂犬病毒gC基因DNA疫苗免疫增强作用。将4拷贝的M28基因与伪狂犬病毒gC基因串联后,克隆到载体pcDNA3.1中,构建融合表达的重组质粒(sgC-M284)。BALB/c小鼠免疫试验表明,sgC-M284免疫组比单独表达伪狂犬病毒gC蛋白的重组质粒(sgC)免疫组产生的ELISA抗体高17倍,对致死剂量(316LD50)伪狂犬病毒攻毒的保护率提高了63%。gC基因与M28基因融合表达诱导产生的IL-4水平接近了伪狂犬灭活疫苗免疫组的产生的IL-4水平,显著增强了基于Th2途径的体液免疫反应。     

小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对其脾脏T细胞的影响

为从细胞水平研究小鼠乳腺表达抗PD-1抗体对转基因鼠脾脏T细胞表面抗原蛋白、细胞因子表达、脾脏CD4⁺T细胞增殖以及增殖相关通路的影响,将8周龄未经历过怀孕的和18周龄经历过哺乳的表达抗人PD-1抗体的转基因小鼠分成两组,每组以转基因阴性鼠为对照,提取脾脏淋巴细胞,检测脾脏淋巴细胞的变化。与转基因阴性小鼠相比,乳腺表达抗PD-1抗体的转基因小鼠的免疫系统中的脾脏T细胞的效应T细胞比例上升,Treg细胞比例下降,CD4⁺T细胞表达的IFN-γ、IL-17以及IL-2有不同程度的增加。IL-4、IL-10以及TGF-β都没有发生变化。与T细胞刺激相关的一些细胞表面的蛋白分子也没有引起变化。转基因阳性鼠和转基因阴性鼠中T细胞增殖没有显著性差异,转基因阳性鼠中PI3K/Akt/mTOR和Ras/MEK/ERK这两条通路上的磷酸化蛋白只有部分表达上调,整个通路没有完全上调。结果表明,转基因小鼠作为表达抗PD-1抗体这类免疫系统相关单克隆抗体的宿主是可行的。     

伤寒Vi多糖结合疫苗免疫小鼠后的抗体类型及动态分析

伤寒Vi多糖结合疫苗和Vi多糖疫苗分别免疫小鼠,分离血清,采用间接ELISA法测定不同时点血清中特异性IgA、IgM、IgG及其亚类(IgG1、IgG2a、IgG3)的抗体滴度。结果显示,免疫一针后,Vi多糖结合疫苗组的IgG抗体GMT值明显升高,第二针有加强效应(P<0.01);所测3种IgG亚型中IgG2a抗体滴度升高明显;Vi多糖和结合疫苗免疫小鼠后,血清中IgA和IgM抗体滴度均有显著升高,但无加强应答。显示Vi多糖结合疫苗在诱导小鼠血清IgG应答方面有加强效应。