人受精蛋白β整联蛋白配体区cDNA的克隆、表达及抗体制备

从人睾丸中抽提mRNA,合成双链cDNA,利用合成的PCR引物扩增受精蛋白β（fertilinβ）的整联蛋白配体区cDNA（hf279)。序列分析表明,该区编码93个氨基酸,与文献报道安全相同。将hf29插入质粒pGEX－4T－2,构建pGEX-hf279表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达菌株经IPTG诱导,可产生大量可溶性的表达蛋白GST－HF93。SDS－PAGE分析表明融合蛋白表观分子量为38kD,其含量占菌体可溶性蛋白的50％以上。表达产物经谷胱甘肽转硫酶（GST）亲和层析柱纯化,得到90％以上纯度的凳晤蛋白。融合蛋白经凝血酶切2h可得HF93肽。再经GST新和层析柱去除GST,得到纯度大于80％的HF93肽。将其和SDS－PAGE凝胶上切下的HF03多肽条带一起用于免疫BALB／c小鼠,经ELISA检测,证明获得了较高滴度的抗体。     

精子头后部质膜融合蛋白fertilin的研究进展

精子头后部(或赤道区)表面fertilin糖蛋白由相关的两个跨膜亚基α和β构成异二体形式。这两个亚基前体均含有金属蛋白酶区(met-alloprotease domain)和整联蛋白配体区(disin-tegrin domain),属于ADAMs gene家族。α和β前体分别在睾丸和附睾中从上述两区域连接处水解后,得到成熟型亚基。受精时,穿过透明带的顶体反应后精子借助β亚基的disintegrin肽段与卵母细胞表面的整联蛋白结合,同时fertilin结构发生变化,暴露出α亚基上潜在的融合肽段(90—111aa),并介导精子与卵母细胞发生质膜融合,最终完成受精过程。     

大肠杆菌YggG与结合蛋白Era的相互作用研究

Era是细菌生长必须的一高度保守的GTPase。yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,进一步的研究表明该基因在大肠杆菌中的表达与环境应激相关,提示yggG基因产物参与细菌的应激调控。为了阐明YggG蛋白与Era蛋白间的相互关系,利用所构建的双启动子表达载体pDH2-YggG-Ptac-Era在同一细胞中同时表达YggG与Era蛋白,并通过免疫共沉淀实验检测细菌裂解产物YggG与Era蛋白间的相互作用;在此基础上,构建并表达纯化了GST融合的Era蛋白氨基端截短肽和Era羧基端截短肽,通过GST Pull-down检测了Era不同功能区域与YggG蛋白间的相互作用。结果显示, Era/YggG 复合物仅存在于同时过表达Era和YggG蛋白的细菌细胞内,不诱导Era或者不诱导YggG蛋白过表达,均检测不到Era/YggG 复合物存在;纯化的GST不能Pull-down YggG蛋白,而纯化的GST融合的Era蛋白、Era氨基端截短肽及Era羧基端截短肽均可以Pull-down YggG蛋白;GST融合Era氨基端截短肽和GST融合的Era蛋白对YggG蛋白结合作用明显高于GST融合的Era蛋白羧基端截短肽。上述结果说明,YggG是一大肠杆菌Era结合蛋白,YggG与Era的氨基端和羧基端的结合活性存在差异。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

细胞核受体LXRβ的体外酶标测活方法的建立与应用

目的:克隆并表达大鼠细胞核受体LXRβ配体结合区(LBD)序列,并进行配体依赖性受体与共激活因子结合区短肽相互作用的酶标法分析,建立简易经济可靠的体外高通量筛选LXR调节剂方法.方法:从含大鼠LXRβ cDNA序列的pSG5/rLXRβ上扩增LBD区序列,测序核实序列后,将此序列克隆入表达载体,构建原核表达载体pET28a(+)-rLXRβ-LBD;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting检测及Ni2+亲和层析柱分离纯化;建立ELISA方法检测配体依赖性受体-共激活短肽相互作用.结果:重组蛋白rLXRβ-LBD在大肠杆菌中高效表达(占菌体总蛋白30%),SDS-PAGE显示在36kDa处有免疫特异性蛋白,纯化后全长蛋白占90%以上.ELISA结合测试显示在激动剂猪脱氧胆酸二甲酰胺存在时,rLXRβ-LBD能与共激活短肽结合,亲和力与双荧光酶报告基因测活结果吻合.结论:成功克隆并表达rLXRβ-LBD序列,建立起ELISA筛选方法,为LXR-LBD配体功能活性的研究和配体的高通量筛选提供新方法.     

受精蛋白β在人精子表面的免疫组织化学定位

以人受精蛋白β整联蛋白配体区为抗原免疫小鼠并制备单抗,应用免疫组化方法研究了受精蛋白β在不同状态人精子表面的分布规律.结果表明受精蛋白β散在分布于新鲜人精子的头部,获能后则向顶体区集中,顶体反应过程中同时出现表达量及分布位置的急剧变化,最后定位于精子头后部.其分布规律与动物受精蛋白有所不同.受精蛋白β在人精子表面分布的位置及其变化揭示其在受精过程中的重要作用.     

人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化

作为开发新型实用性人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的一种尝试, 我们已构建若干组合靶抗原三个线性B- 细胞表位和外源强T- 细胞表位的基因工程hCG嵌合肽。为了检测用这些嵌合肽免疫的动物血清中是否能产生抗各表位的三种抗体,本研究选用能在大肠杆菌中高表达和与生物素亲和性强且特异(方便通过亲和层析纯化)的链霉亲和素为载体,分别构建了三种含β-hCG不同单一线性B_细胞表位(β5,β9和β8)的融合蛋白。在链霉亲和素基因下游多克隆区EcoRⅠ和Hind Ⅲ位点插入各表位编码基因片段(带TAA终止密码子)的pTSA-18重组质粒, 转化BL21(DE3)pLysS宿主菌后, 它们在IPTG诱导下均能以较高水平表达各自目的融合蛋白,而且它们的表达产物在Western blot鉴定中都能被抗各表位特异的多抗或单抗或抗报告表位单抗识别。用改良的制备性PAGE方法可以一步纯化电泳均一性高于95%的三个融合蛋白, 它们的收得率相对1L培养物约为5 mg。作为化学合成表位肽的替代物, β-hCG三个单一B- 细胞表位融合蛋白的可获得性将有助于所构建hCG基因工程嵌合肽以及其他hCG疫苗,也包括它的DNA疫苗的免疫原性分析。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

锥虫早老素蛋白亲水区的克隆和表达纯化

目的体外表达锥虫早老素蛋白亲水区肽段,以制备抗血清用于功能研究。方法根据锥虫早老素蛋白二级结构特性,设计引物分别扩增N端及C端片段的亲水区肽段基因,装入原核表达载体进行表达,并通过变性纯化方法获得足够量表达蛋白,制备兔抗血清。结果成功扩增并克隆锥虫早老素蛋白亲水区片段L2及L7．并分别采用变性磁珠法和变性树脂法进行大量蛋白产物纯化,浓缩纯化产物制备兔抗血清经Westem blot杂交验证,出现目的蛋白大小阳性条带。结论成功表达锥虫早老素蛋推测N端及C端亲水肽段,并成功制备抗血清．可用于锥虫早老素蛋白功能分析。     

香鱼TGF-β1基因的克隆及其表达与鳗利斯顿氏菌感染的相关性

通过转录组测序的方法,获得香鱼的TGF-β1基因序列,由1134个核苷酸组成,包括一个大的开放阅读框,编码成377个氨基酸组成的前体蛋白,分子量大小为43 kDa,等电点为8.72。N端前19个氨基酸为信号肽,成熟肽由C末端112个氨基酸组成,分子量大小为12.5 kDa。序列比对表明香鱼与虹鳟同源性最高,前导肽为72%,成熟肽为93%。在健康香鱼中,TGF-β1基因在肝、脾、肾、脑、肌、肠、鳃、心组织中均有表达,在肾组织中表达量最高。鳗利斯顿氏菌侵染香鱼组织后,各组织中的TGF-β1基因mRNA表达量均显著上调,肾组织中变化最为显著,注射12h时为对照组的14.5倍。构建了原核表达质粒pET-28a-TGF-β1,并制备了多克隆抗血清,能与目的蛋白TGF-β1起特异性反应,但不与细菌蛋白自身反应。以上结果表明,香鱼TGF-β1基因表达变化与鳗利斯顿氏菌的侵染相关,揭示了TGF-β1可能在鱼类抗细菌的急性期免疫应答过程中发挥作用。     

A REINTERPRETATION OF THE ONTOGENY OF THE ASCOCARP OF SPECIES OF THE ERYSIPHACEAE

A study of four species of Erysiphaceae (Uncinula salicis, Podosphaera leucotricha, Erysiphe cichoracearum, and Microsphaera diffusa) revealed that the binucleate stages of the ascocarp are initiated in a similar manner to those of Diporotheca rhizophila Gordon & Shaw. The “appendages” developing on immature ascocarps are considered to be receptive hyphae. Appendages characteristic of mature ascocarps are produced much later. Lysis of certain centrum cells occurs, and asci are initiated from some of the remaining binucleate centrum cells. Resorption of centrum cells by the asci is supported by this investigation, corroborating Björling's earlier studies on Erysiphe graminis.