链霉素产生菌——灰色链霉菌质粒的分离和电镜观察

链霉素产生菌——灰色链霉菌(Streptomyces griseus)No.45经36℃处理后,获得了气生菌丝生长受抑制的突变体,这些高温突变体全部丧失了合成链霉素的能力。从遗传学上验证表明:灰色链霉菌中分离得到质粒DNA(SGPI),并用电镜进行了观察证实。     

短小芽孢杆菌抗药性质粒pCJ3的分离及分子特性的研究

从短小芽孢杆菌中分离出具有四环素抗性的质粒pCJ3,经抗性消除试验、转化活性测定、琼脂糖凝胶电泳分析和电镜观祭等方面试验得到证实。电镜观察表明pCJ3质粒DNA分子具有共价闭合超螺旋环状和开放型环状两种构型。根据经验公式计算其分子量为4.33×106。     

链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

链霉菌基因克隆载体及基因文库的构建

利用麦迪霉素产生菌中分离的质粒pSMY1(10．8kb),将pIJ30的硫链丝菌素抗性基因(tsr)克隆到psMY1上,获得了具有硫链丝菌素抗性选择标记质粒pSJ10。通过DNA体外缺失,片段播入、λ-COS片段的插入及与大肠杆菌质粒的重组等基因技术,获得了一系列psMY1衍生质粒,包括双标记质粒pSM3,大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒pBMJ2和穿梭粘粒pNMJ1。通过对这些质粒的分析,确定了质粒psMY1的复制必需区为3．06kd的EcoRI—sphI片段。质粒pSJ10、pSM3、pNMJ1具有可选择标记,多个单一确切的可克降位点,有一定范围的宿主并能在链霉菌中稳定存在等特点,故可作为链霉菌基因克隆的载体。其中pNMJl(11．15kb)是大肠杆菌／链霉菌穿梭粘粒,能有效地运载28—38kb的外源DNA片段,并能在体外包装λ噬菌体外壳,转导大肠杆菌。利用载体pNMJl,通过λ-噬菌体蛋白体外包装,在大肠杆菌中建立了螺旋霉素产生菌的基因文库,其基因覆盖率可达90％。重组DNA分子可通过转化转移到链霉菌中。     

嗜热链霉菌质粒的研究

从分属于12个种的28株嗜热链霉菌中检测到热灰紫链霉菌(S.thermogriseoviolaceus)T272带有3个质粒(pST1,pST2,pST3),热藤黄链霉菌(S.thermoluteus)T422带有1个质粒(pST4),经电镜观察得到证实,并按经验公式求得其分子量分别为27、8.3、6.9、25.7kb。实验数据表明,T272与利福平抗性有关的基因可能位于质粒pST1;而pST4可能与rRNA甲基化酶合成有关,推测该酶使T422具有红霉素、螺旋霉素、林可霉素抗性。未发现这些质粒与宿主的高温生长特性有关。     

庆丰链霉菌质粒DNA的分离及电镜观察

本文报道用清亮裂解液PEG沉淀法从庆丰链霉菌M-15菌株中分离到质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳用溴化乙锭染色及CsCl-EtBr密度梯度离心,在紫外线下观察均表明除了染色体带之外还有一条质粒带。我们摄制的电镜照片表明存在共价闭合超盘旋和开放环形两种分子构型,以多数大小相近的分子周长取平均值,按1微米=2.07×10~6道尔顿的公式计算,庆丰链老菌质粒DNA分子量约为10×10~6道尔顿。     

玫瑰红链霉菌336质粒（pSR336）DNA的分离及特性研究

从葡萄糖异构酶产生菌──玫瑰红链霉菌３３６中分离得到质粒ｐＳＲ３３６。经电泳检测和电镜观察证实,存在共价闭合超螺旋和开环两种分子构型,分子量约为６．３５ｋｂ,拷贝数约为１３０。采用高温（４０℃）,吖啶橙、溴化乙锭和ＳＤＳ等物理、化学因素消除ｐＳＲ３３６,均未获得质粒消除株,表明ｐＳＲ３３６质粒是非常稳定的。用变铅青链霉菌ＴＫ２１作受体,进行平皿杂交以检测ｐＳＲ３３６的接合转移能力,未观察到麻点（ｐｏｃｋ）的形成。用ＨｉｎｄⅢ分别酶切ｐＳＲ３３６和ｐＩＪ４８６,连接得到一个嵌合质粒ｐＩＲ３０,检测玫瑰红链霉     

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748的质粒Psmyi及其特性的研究

从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces,mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,测定pSMYl的分子量为7．17×10⁶道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA,构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在,且具有形成麻点(pock)的特性。     

黑暗链霉菌DNA转移系统的建立

研究了黑暗链霉菌的基因转移系统,探索了通过PEG介导的原生质体转化、接合转移向黑暗链霉菌中转入外源DNA的可能性。多次尝试用质粒pIJ702转化黑暗链霉菌9904原生质体均未成功。对原生质体进行“热处理”后转化、利用单链DNA转化等都不能将质粒导入黑暗链霉菌中,表明黑暗链霉菌对外源DNA有很强的限制修饰作用。利用接合转移将具有oriT的大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pHZ132转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中,获得供体菌ET12567(pUZ8002,pHZ132)。将供体菌与预萌发的黑暗链霉菌9904的孢子进行接合转移,成功地将pHZ132转入黑暗链霉菌9904中。质粒pHZ132经黑暗链霉菌自身修饰后也可转入黑暗链霉菌9904菌株的原生质体中,转化率约为103/μg DNA(pHZ132)。     

不吸水链霉菌梧州新亚种限制-修饰系统初探

采用菌丝体原位包埋方法和高压脉冲电泳技术从不吸水链霉菌梧州新亚种(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis neosubsp. 11371)中分离得到两条质粒DNA带.通过双向电泳证明,2个质粒均为线性分子,按照分子量大小依次命名为pSAL1、pSAL2.并对不吸水链霉菌梧州新亚种的限制-修饰系统进行初步探讨:将来自变铅青链霉菌TK54的高拷贝质粒pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种原生质体,未能得到转化子,改用pIJ702转化不吸水链霉菌梧州新亚种U-3原生质体,得到了转化子.     

圈卷产色链霉菌分化基因sawB的结构与功能

以Sau3AI部分酶切野生型圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)染色体DNA,回收3～6 kb的DNA片段,插入到链霉菌表达载体pIJ702的BglⅡ位点,转化圈卷产色链霉菌白色突变株W19,得到了近3 000个转化子,从中筛选到了两个具有硫链丝菌素抗性和野生型灰色表型的转化子.进行了质粒提取和酶切分析,两个重组质粒分别命名为pNL-1和pNL-2(分别含有约5.2和5.8 kb的外源片段).通过亚克隆及突变株互补实验,将互补W19的基因定位在了1.25 kb的Pst Ⅰ-Apa Ⅰ片段上.DNA序列分析结果表明,该DNA片段中含有一个完整的可读框(ORF1),编码一个由295个氨基酸组成的蛋白质,该基因命名为sawB.利用Blast程序在蛋白数据库中比较发现,SawB与天蓝色链霉菌的一个转录调控蛋白WhiH具有81%的一致性.利用基因破坏策略研究了sawB的功能,结果发现,野生型菌株的sawB基因破坏后,丧失了孢子形成能力,由灰色表型转变为白色表型.显微镜下观察sawB突变株的气生菌丝长而直,顶部略有波浪形卷曲,螺旋程度有所下降.由此可知,sawB是与圈卷产色链霉菌形态分化有关的一个重要基因,它与菌丝螺旋及孢子形成直接相关.sawB的异源表达分析表明,sawB可互补天蓝色链霉菌whiH突变株C119,使之恢复到野生型表型,产生紧密螺旋及丰富的灰色孢子.     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的研究

将麦迪霉素产生菌基因文库中与放线紫红索酮基还原酶基因actⅢ有同源性的4·0kb DNA片段克隆到质粒载体pWHM3中,构成重组质粒pCB4。将质粒pCB4转入酮基还原酶基因缺陷菌株——加利利链霉菌ATCC3167l中,得到转化子。转化子发酵产物经TLC和HPLC分析证明是阿克拉菌酮,与加利利链霉菌原株ATCC31133的产物相同,说明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因互补了加利利链霉菌ATCC31671中缺陷的酮基还原酶基因,使其恢复了产生阿克拉菌酮的能力。4．Okb DNA片段插入方向相反的重组质粒pCBR4在加利利链霉菌ATCC31671中发酵产物经TLC分析证明也是阿克拉菌酮,这说明4．0kbDNA片段中麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因具有自身的启动子。对4．0kb DNA片段进行了限制酶酶切分析,建立了其酶切图谱。以actⅢ基因为探针,经分子杂交以及亚克隆和DNA转化实验,将麦迪霉索产生菌酮基还原酶基因定位于BssH Ⅱ—BamH Ⅰ 1．3kb DNA片段上。对1．3kb DNA片段核苷酸序列分析结果表明：此1．3kbDNA片段中含有一个独立的ORF,起始密码ATG,终止密码TAG,含783bp;在起始密码上游有GGAGG5个核苷酸SD序列;此ORF编码260个氨基酸,与actⅢ基因编码的261个氨基酸相似性为77．4%,相同性为66．7％,对麦迪霉素产生苗酮基还原酶基因的可能作用进行了讨论。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

两类新型DNA质粒pSC1和pSC2的分离与观察

本文报道从一株啤酒酵母E4-2A分离到两类脱氧核糖核酸质粒pSC1与pSC2。经琼脂糖凝胶电泳分离质粒DNA分子,证明这两类质粒的分子量不同于已知的酵母2μmDNA质粒。电镜分析指出这两类新型核外DNA质粒的长度为0．91士0·12μm(pSCl)和0.48士0.10μm(pSC2),经计算分子量分别相当于1．9x106和1．0 x106。pSCI由共价闭环和开环两种构型组成,而pSC2仅有开环型。     

乙型肝炎病毒HBV基因组的物理结构

在Dane颗粒(乙肝病毒)的核壳体中存在环状DNA分子和内源性DNA聚合酶。该基因组为3200个核苷酸长并且有特征性的结构,即有长度不等的单链区。Summer等提出了两条不等长度链的模型,即一条具有固定长度的长链(L链)和一条可变长度的短链(S链)。最近的实验证实了此模型并使其更加精细了(图3)。     

西藏土壤中分离的链霉菌含有丰富的线型和环型质粒

【目的】研究极端自然环境对链霉菌线型和环型质粒分布的影响。【方法】从西藏高原采集了20份土壤样品,分离和初步鉴定链霉菌,提取和检测质粒DNA。【结果】从中分离到46株链霉菌,其中有23株菌含有1 4个线型质粒,大小在19 650 kb之间,8个菌株含有1 4个环型质粒,大小在4 80 kb之间。【结论】西藏土壤来源的链霉菌含有大量的、多样的线型质粒和环型质粒,暗示极端环境中诸如强紫外辐射等可能会引发DNA损伤和修复,进而造成质粒的多样性。     

质粒DNA超螺旋构象的激光喇曼光谱研究

将pBR322重组质粒DNA纯化,经琼脂糖凝胶电泳鉴定其主要具共价闭合环状空间构象。对此制备物进行激光喇曼散射光谱分析,发现在表征其二级结构为B型的特征模之外,还有另外二个表征磷酸脱氧核糖主链骨架振动状态的特征模854和1083cm~(-1)。本文对此进行探讨,认为这二个特征模与闭合环状DNA分子的超螺旋状态有关,可作为质粒DNA三级结构的特征模。碱基堆积状态分析表明,超螺旋的存在使分子中脱氧胸苷的堆积反应活性增强,并使AT碱基间Hoogsteen型氢键有相当数量的破坏,导致反映脱氧胸苷参与氢键组成的二个基团振动状态的特征模1378cm~(-1)产生相对于线性DNA分子的明显减色及脱氧胸苷羰基双键振动模向高波数偏移。     

灰色链霉菌启动子活性片段在大肠杆菌中的亚克隆及其序列分析

通过对重组质粒No.8-1的亚克隆,灰色链霉菌插入到大肠杆菌载体质粒中的序列已缩小到410bp,仍具有启动子功能。序列分析表明,启动子活性片段的G C碱基组成为50.5%。内含链霉菌启动子区域常有的正向重复序列;有1个Alul位点,1个Clal位点,2个Mbol位点,3个Nla Ⅲ位点,1个Pvu Ⅱ位点;具有类似于E.coli启动子的保守序列-10区和-35区,两者间隔18bp;在相应位置上分别有一段序列与E.coli的SD序列和在苄铅青链霉菌的SEP(Streptomyces-E.coil-type promoter)序列中存在的保守序列具有一定的相似性。     

链霉菌大肠杆菌穿梭质粒载体pSGLgpp的构建及应用

质粒pSGL1(74kb)是从球孢链霉菌(\%Streptomyces geobisporus)\%中分离得到的一个高拷贝质粒,已测定其最小复制子序列。从球孢链霉菌总DNA中采用PCR方法扩增获得编码C1027前蛋白信号肽的DNA片断gpp。将gpp克隆至pSGL1的衍生质粒pSGLN中,获得新的链霉菌表达型质粒载体pSGLgpp。应用该质粒进行了人的河溶性白细胞介素1受体I型的表达。     

麦迪霉素产生菌中与孢子色素聚酮体生物合成相关的酮基还原酶基因

研究了麦迪霉素产生菌-生米卡链霉菌1748的原生质体形成、再生和DNA转化条件,建立了生米卡链霉菌1748的DNA转化系统.麦迪霉素产生菌酮基还原酶(MKR)基因利用大肠杆菌-链霉菌穿梭温敏型质粒pKCll39(Am^R)进行基因中断实验,结果表明了发生同源交换的重组子在含Am的MY培养基上形成白色孢子,而生米卡链霉菌1748在MY培养基上形成灰色孢子.以MKR基因为探针的South-ern杂交结果证明重组子中确实发生了同源交换,发生了基因中断的重组子仍然产生麦迪霉素.这一结果证明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的生物功能是参与麦迪霉素产生菌中决定孢子色素的聚酮体的生物合成,与麦迪霉素的生物合成无关.重组质粒pCN8B12来自麦迪霉素产生菌基因文库,是以pNJ1为载体,插入了28kbDNA片段,该片段中既有与actⅠ同源的区域也有与actⅢ同源的区域.