小鼠热休克蛋白gp96羧基端片段的克隆、表达及纯化

热休克蛋白(Heat shock protein)gp96(Grp94)是近年来新发现的一类糖蛋白,除了分子伴侣的功能外,现有越来越多的献报道了它在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用。gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌。热休克蛋白抗原肽复合体可以引起特异性的细胞毒T淋巴细胞效应,应用这个特点可以设计抗病毒及抗肿瘤药物。但是gp96全长分子量大,蛋白在大肠杆菌中表达量低,不稳定,难纯化。组织提取的gp96又受组织来源和样品量的限制。对gp96的结构和功能的研究带来困难。克隆并表达了小鼠热休克蛋白gp96的羧基端560．751aa约四分之一长的功能片段,该段包含gp96的一个肽结合区和二聚化位点。将该功能片段在大肠杆菌中进行融合表达,纯化后将融合的片段切掉,并对目的片段进行了分析,结果表明该段可能是形成二聚体密切相关的片段,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

人热休克蛋白gp96基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与纯化

热休克蛋白gp96是热休克蛋白90家族成员,能够引起非特异性和特异性免疫反应。得到大量高纯度的蛋白质是研究开发gp96的关键。然而重组的gp96容易在E．coli中降解,并在一定条件下形成多聚体。实验先将人gp96基因克隆到pET-30a载体上并在E．coli Blstar中表达,再经过亲和层析、阴离子交换、分子筛分别纯化gp96。最终去掉了大部分的降解片段和多聚体,得到一定量的可溶性gp96,为进一步研究其结构和功能打下一定的基础。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmK IT,通过PCR方法在BmK IT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽 Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点（MCS）。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IT^his6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex 75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IT^his6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmK IT,通过PCR方法在BmK IT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽 Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点（MCS）。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IT^his6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex 75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IT^his6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

PEG修饰有效提高热休克蛋白gp96抑制性多肽抗乳腺癌的功能

乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的肿瘤,严重威胁女性生命健康。其中三阴性乳腺癌因其特殊的生理学特点,成为乳腺癌中预后最差的亚型,因此急需寻找新的靶点进行治疗来提高患者预后及生存率。多项研究表明,热休克蛋白gp96在多种癌细胞的膜表面过表达,且胞膜gp96与乳腺癌的恶性程度与不良预后密切相关,因此其可能是乳腺癌治疗的新靶点。前期研究根据gp96的结构,开发一种靶向胞膜gp96 ATP结合区的α螺旋肽p37。虽然p37多肽作用位点专一,但其在体内容易被降解,因此本研究将多肽的N端或C端分别偶联PEG₂₀₀₀或PEG₅₀₀₀,得到4个具有抑瘤功能的PEG多肽：mPEG₂₀₀₀CY、mPEG₅₀₀₀CY、mPEG₂₀₀₀LC和mPEG₅₀₀₀LC。它们可以抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的增殖和侵袭,其中抑制效果最明显的是mPEG₂₀₀₀CY。经测定,mPEG₂₀₀₀CY在体内的半衰期较多肽p37明显延长,且有效抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231小鼠移植瘤的生长。这为研发新型抗乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌的靶向药物提供了依据。     

水稻rab5B基因在大肠杆菌中的表达、纯化和GTP结合分析

Rab5B类蛋白因为其编码产物的N端具有特殊结构而被认为是一类特殊的蛋白质.水稻rab5B基因Osrab5B是这类蛋白质基因在单子叶植物中的首例发现.将Osrab5B基因的编码序列按正确读码框重组到具有谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）融合标签的pGEX-4T1表达载体中,转化大肠杆菌,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株,经GSTrap^TM柱纯化,获得了纯化的目标融合蛋白.GTP结合试验表明,在原核细胞中表达出的GST-OsRab5B融合蛋白具有体外结合GTP的能力.     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

热休克蛋白-多肽复合物在肿瘤和传染性疾病免疫中的作用

热休克蛋白家族中的许多成员如gp96\,HSP90\,HSP70等具有排斥和治疗肿瘤及传染性疾病的免疫原性,进一步研究发现热休克蛋白作为分子伴侣可结合细胞中的肽库,它本身没有抗原性,抗原性由结合的短肽所决定。热休克蛋白将结合的短肽呈递给I类MHC分子,进而激活特异性CTL和记忆性T细胞,引发机体细胞免疫反应。据最新发现gp96还可能有与MHC一样的功能,可直接将结合的多肽抗原呈递给T细胞。近年来对哺乳动物的二种主要热休克蛋白gp96和HSP70的免疫机制和作为治疗性疫苗的优越性进行了详细研究,这为乙型肝炎和乙肝继发性肝癌的免疫治疗提供了新思路。     

盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L^-1 NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10; 正交结果显示诱导温度27 ℃,诱导转速200 r·min^-1,IPTG浓度0.7 mmol·L^-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白; ELISA检测抗HcPR10血清效价达1:243 000,Western Blotting印迹结果显示制备的抗血清可以与重组蛋白和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异源表达的HcPR10蛋白特异性结合。该研究获得了效价高、特异性强的盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清,为进一步研究HcPR10的亚细胞定位及生物学功能奠定了基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.