链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

铜绿色假单胞菌AS1.860中萘质粒的分离和鉴定

本文报道了一种新的萘降解质粒ND1.860。铜绿色假单胞菌AS1.860经碱-SDS裂解,氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心,得到质粒DNA。通过电子显微镜观察到环状DNA分子,并根据轮廓周长推算其分子量为38.1×10~6道尔顿。ND1.860经过EcoRI消化产生10个片段,HindⅢ消化产生9个片段,由琼脂糖凝胶电泳得到的限制图谱与已报道的萘质粒明显不同。     

氧化硫硫杆菌质粒的分离

用碱法对分离到的7株氧化硫硫杆菌进行质粒检测,在6株中分离到了18个质粒,质粒DNA的分子量为1.3×10~4-98×10~6。     

扁刺蛾核型多角体病毒的形态结构与某些生化特性的测定

扁刺蛾核型多角体病毒是一种单粒包埋型的杆状病毒,在扫描电镜下呈不规则多面体。病毒多角体大小不一致,平均直径为0.59μ。病毒粒子为340×85nm. 经SDS—PAGE分析,病毒的多角体蛋白主带分子量为29500道尔顿;病毒粒子的结构蛋白具有25条多肽,分子量为17.8～69.5×10~4道尔顿。病毒多角体蛋白氨基酸组成中富含Asp和Glu,而His、Cys、Met的含量却很低。病毒DNA的分子量为67.89×10~6道尔顿。     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

鲤鱼、鲫鱼肌细胞线粒体DNA的限制性内切酶酶切图谱比较

鲤鱼肌细胞线粒体DNA经限制性内切酶Bam HI和Eco RI酶切后,皆被切成3个片段;鲫鱼肌细胞线粒体DNA经上述两种限制性内切酶酶切后,皆被切成2个片段。通过琼脂糖凝胶电泳对这些片段进行测定,并分别画出它们的酶切图谱。鲤鱼肌细胞线粒体DNA的分子量约为10.50×10~6道尔顿,有16.99千碱基对;鲫鱼肌细胞线粒体DNA的分子量约为9.40×10~6道尔顿,有15.21千碱基对。     

链霉素产生菌——灰色链霉菌质粒的分离和电镜观察

本工作首次从具有临床应用价值的抗菌素产生菌——灰色链霉菌中分离得到质粒DNA(SGP1),并经电镜观察证实。用琼脂糖凝胶电泳分析,初步证明灰色链霉菌和天蓝色链霉菌质粒DNA分子大小相似,限制性内切酶Eco R1对灰色链霉菌质粒DNA可能只有一个切口。电镜观察表明灰色链霉菌质粒DNA具有共价闭合超盘旋环状和开放形环状两种构型,根据经验公式计算,灰色链霉菌质粒DNA分子量为1．9x107道尔顿左右。经紫外分光光度计测定灰色链霉菌质粒DNA解链温度(Tm值)为80．8u℃ G—C克分子百分数为76．8％。我们所获得的灰色链霉菌质粒DNA(SGP1)是否即是前文报道的[10]经高温消除,并与链霉素生物合成有关的质粒,则尚待进一步证实。     

带有K88与K99两种伞毛抗原基因的重组质粒的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻,K88与K99是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的伞毛抗原。质粒pTK8899—6和pTK8899—8是由来自K99质粒DNA的4．5×10⁶道尔顿大小的BamHI片段与带有K88伞毛抗原基因的质粒pTK90DNA重组而构建成的;带有pTK889g一6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株均能同时产生K88与K99两种伞毛抗原。限制性酶切图谱的研究表明,pTK88g9—6与pTK8899—8 DNA的分子量均为11．85×10⁶道尔顿,但这两种重组DNA中所带Kg9伞毛抗原基因的片段连接在载体DNA上的方向彼此相反,带有pTK8899—6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株在产生K88或K99伞毛抗原的能力上没有明显的差别。带有K88与K99两种伞毛抗原基因重组质粒的大肠杆菌菌株有可能用作预防仔猪,犊牛和羔羊急性腹泻的菌苗。     

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748的质粒Psmyi及其特性的研究

从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces,mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,测定pSMYl的分子量为7．17×10⁶道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA,构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在,且具有形成麻点(pock)的特性。     

杀蚊球形芽孢杆菌BS10的质粒限制图谱

本文报道一株国内分离的具有杀幼蚁活性的球形芽孢杆菌(Bacullus Sphaericus下文简称Bs)的大质粒(pFWl),其分子量为69．5×10⁶道尔顿,绘制了该质粒的xhol限制性核酸内切酶酶图。以苏云金芽孢杆菌以色列变种(Bacillus huringiensis israelensis下文简称BTI)75×10⁶道尔顿质粒为探针与泼菌株DNA进行核酸杂交,结果表明BTI与该菌株为毒素蛋白编码的基因序列之间无同源性,说明它们的进化来源是不相同的。     

杨尺蠖核型多角体病毒的DNA特性

本文报道了AciNPV-DNA的纯化及特性,证明纯化DNA具有典型紫外吸收光谱,在Sepharose 2B柱层析和超离心沉降分析中呈单一峰,Tm值为70.2℃,其(G+C)％=39.8％,增色效应为34％,限制性内切酶Pst Ⅰ,PvuⅡ,SaI Ⅰ,Eco R Ⅰ,BgI Ⅰ,XhoⅠ,Bgl Ⅱ酶切DNA,分别产生4,6,22,20,11,5,7个DNA片段,某些酶切电泳图谱中观察到亚分子片段,Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双醇切DNA分子产生26个片段,Eco R Ⅰ酶切片段积加DNA分子量为56.55×10~6道尔顿,约85.70千碱基对,电镜观察DNA分子有线状和环状,环状分子长约27.38μ,分子量约为53.94×10~(?)道尔顿,以Eco R Ⅰ对1981～1985年林间连续复制回收的AciNPV的DNA同源性进行检测,结果无变化,AciNPV攻毒枣尺蠖幼虫所得枣尺蠖NPV,其DNA的Bgl Ⅱ图谱与AciNPV-DNA的Bgl Ⅰ酶谱有明显的差异。     

部分酶解酵母高效电击转化研究

以酵母质粒YCp50为外源DNA,电击转化部分酶解酵母宿主菌AB1380,转化效率稳定在10~6转化子/μg质粒DNA左右,比不酶解酵母或酵母原生质球作受体的电击转化效率高一个数量级以上,也比PEG介导的酵母原生质球转化高3～5倍,而且适合于大片段DNA如水稻YAC分子的转化。达最佳转化时的有关技术参数为:新接菌种通气培养至细胞密度1×10~8～1.5×10~8个/ml;转化时细胞密度控制在1×10~9～1.5×10~9个/ml;每毫升酶解缓冲液加15u溶菌酶(lyticase),30℃下处理酵母5min进行部分酶解;电击时,电场设置在6.25kV/cm、电容25μF,电击后直接铺板。     

嗜热脂肪芽孢杆菌抗药性质粒的转化

从堆肥和污泥中分得8株抗药性高温细菌,经电泳检查有质粒存在,对其中1株具有卡那霉素和链霉素抗性的嗜热脂肪芽孢杆菌T617-8的质粒DNA,用电镜测得分子量为26.6×10~6道尔顿。T617-8(Km~rSm~r)菌株经溴化乙锭处理后,对卡那霉素敏感,同时质粒消失。为此确证,卡那霉素抗性是由质粒所控制。以T617-8的质粒(Km~r)DNA,对消除质粒后的菌株(Sm~r)的原生质体进行转化,获得了抗卡那霉素和链霉素的转化子。     

丁酰苷菌素产生菌Bacillus circulans3342质粒pBCl的分离及其性质

在氨基寡糖类抗生素丁酰苷菌素的产生菌Bacillus circulans 3342中发现了一种质粒DNApBC1,其分子量为9.0×10~6道尔顿。 用限制性内切酶BglⅠ、SmaⅠ和Hind Ⅲ酶切这种质粒DNA,构成了pBC1的限制性内切酶图谱。selⅠ、SmaⅠ和Hind Ⅲ分别将这种质粒DNA切为2、2和5条片段,EcoRI则切为4条片段,而SalⅠ、Bam HI和Pv(?) Ⅱ不能切这种质粒DNA。     

灭蚊球形芽孢杆菌Ts-1中大质粒pNT-1的分离和电子显微镜观察

由我国筛选的灭蚊球形芽孢杆菌Ts-1中分离到一种大分子质粒pNT-1,通过电子显微镜观察到环状DNA分子,根据轮廓周长推算其分子量为114.13×106道尔顿。本文还报道了球形芽孢杆菌中大质牡的分离纯化方法。     

转座子Tn233(CH)分子量的测定

转座子Tn233(CH)带有str sul抗性基因,最早是在痢疾杆菌的抗药质粒DR233(Tc~r Cm~r Sm~r Su~r)中发现的。现在通过菌株间的配对,将插入了Tn233(CH)转座子的质粒R144drd3::Tn233(CH)转移到E·coli C600/pBR322(Ap~r、Tc~r)细胞中,组成两种质粒共存的菌株。从此菌株中提取出质粒DNA,用转化方法使它转移到E.coli C600菌株,再从所得到的转化子中用复印方法筛选出Tn233(CH)转座到pBR322质粒的转化子E.coli C600/pBR322::Tn233(CH),然后提出此质粒DNA,经限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ等酶切后,在琼脂糖凝胶平板与聚丙烯酰胺凝胶柱上进行电泳分析,分别以BamHⅠ与EcoRⅠ双重酶解的λDNA、HindⅢ酶解的T5DNA、HaeⅢ酶解的M13 DNA与HaeⅢ酶解的pBR322 DNA作为泳动的标记,计算出质粒酶解片段的分子量,用此方法算出各片段分子量的总和为15.93×10~6道尔顿,此即为所求的pBR322::Tn233(CH)分子量,将此值减去pBR322的分子置2.87×10~6道尔顿,得到Tn233(CH)的分子量为13.06×10~6道尔顿。电泳结果还表明在Tn233(CH)DNA分子上,BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ与PvuⅡ分别有5、9、1、6、2个切点数。     

大豆脲酶基因片段的无性繁殖

纯化的大豆细胞总DNA及质粒pBR322DNA分别经限制性内切酶HindⅢ切割,并用T_4DNA连接酶连接,进行重组。将重组后的DNA转化Escherichia coli C600。用四环素、环丝氨酸富集法浓缩和筛选对氨基苄青霉素具有抗性而对四环素敏感的重组转化子(Ap~rTc(?))。以酚红的显色反应及以脲素为唯一氮源从Ap~rTc~(?)转化子中筛选具有脲酶活性的无性繁殖系,获得一株转化子E.coli C600(pSH120),并从中分离了重组质粒pSH 120 DNA,经凝胶电泳法测定其分子量为12.9×10~6道尔顿。用重组质粒pSH 120 DNA分别转化E.coil C600和E.coliHB101,均能再产生具有脲酶活性的Ap~rTc(?)重组转化子。     

泡桐丛枝病病原及其核酸的分离与性质研究

用0.3M的甘氨酸缓冲液(含0.1M的MgCl_2,pH7.4)对泡桐丛枝病病树的新鲜或冰冻组织进行抽提,用蜗牛酶处理,并差速离心,获得泡桐丛枝病类菌原体;然后用蛋白酶E处理,苯酚和氯仿抽提,酒精沉淀,可有效地制备得泡桐丛枝病类菌原体总核酸。所得总核酸在0.6％的琼脂糖凝胶电泳时呈现出大分子和小分子两种电泳带。DNase I RNase A及专一性降解单链核酸的S.酶等分析结果表明,大分子带为DNA,小分子带为RNA,且DNA具有双链性质,RNA具有单链性质。将上述总核酸用RNase A消化,苯酚和氯仿抽提,乙醇沉淀,可获得单一的泡桐丛枝病类菌原体DNA。电泳测得其DNA分子量约为1.5×10~7道尔顿。目前国内外均未见泡桐丛枝病类菌原体核酸报导。     

大肠杆菌的一个转座子Tn2981的特性

在复旦大学校园分离到1株带有抗药性质粒pFD13(Sm~RSu~RCm~RTc~RHg~R)的大肠杆菌B7,并在pFD13上发现1个转座子,它带有链霉素(Sm~R)、汞盐(Hg~R)、磺胺嘧啶(Su~R)抗性基因,定名为Tn2981。Tn2981可以从质粒pFD13转座到质粒R144drd3上,也能从质粒转座到大肠杆菌的染色体上。这种转座作用不依赖于宿主细胞reeA的基因产物。经电子显微镜测量质粒pBR322::Tn2981及质粒pBR322的长度,换算后得到Tn2981分子量是12.48×10~6道尔顿,并经限制性内切酶酶切说明它含有6个EeoRI切点。     

热带假丝酵母79线粒体DNA的研究

本文报道了热带假丝酵母线粒体DNA的分离纯化、性质和酶切图。此线粒体DNA用电镜观察有线状、开环状和闭环状三种形状;在氯化铯中浮力密度为1.691g/cm~3;解链温度为80.0℃。限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和PstⅠ在此线粒体DNA上分别有6、5和3个切点。根据酶切片段计算分子量为22.97×10~6道尔顿。同时,用双酶切方法得到此线粒体DNA的内切酶图谱。