一种遗传转化方法在海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)中的应用

海洋红酵母作为一种产油微生物富含油脂和类胡萝卜素,但由于没有合适的遗传操作方法,无法对细胞反应器进行理性改进,阻碍了它的进一步发展。首先利用农杆菌介导转化成功构建了海洋红酵母的遗传操作平台。参考完成基因注释的圆红冬孢酵母基因组信息,分离其甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子,以基于圆红冬孢酵母密码子优化的潮霉素作为筛选标记,构建载体转化至农杆菌AGL1中,利用农杆菌介导转化成功得到潮霉素抗性表型正确的转化子,通过表型验证,基因型验证以及Western blot在蛋白水平验证,鉴定了hyg基因的有效表达,证明了外源抗性基因成功导入海洋红酵母菌株中,实现了海洋红酵母新的转化方法的建立。     

高效的酵母完整细胞转化法

以穿梭质粒PYES2转化酿酒酵母H158,用二硫苏糖醇（DTT）和处理酵母细胞,变性单链鱼精DNA（ssDNA）为质粒DNA的携带体;转化率比普通酵母完整细胞转化法提高200倍,可达8．3×104个转化子/μg质粒DNA。     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

海洋红酵母Y2发酵产类胡萝卜素条件的研究

目的 对海洋红酵母Y2高产类胡萝卜素的发酵条件进行优化.方法 在摇瓶条件下,研究培养基成分和培养条件对海洋红酵母Y2生长和类胡萝卜素合成的影响,同时进行海洋红酵母Y2发酵过程的动态分析.结果 海洋红酵母Y2优化培养基组合为葡萄糖45 g/L,蔗糖15 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨2.5 g/L,磷酸二氢钾1 g/L,磷酸二氢钠3 g/L,硫酸镁7.5 g/L,氯化钾3 g/L,氯化钠5 g/L.最适培养参数为:温度20℃,培养基初始pH为5,接种量为10％,250 mL摇瓶装液量为10～50 mL.类胡萝卜素的合成主要集中在对数生长期和稳定期.海洋红酵母Y2最适收获时间为72 h.种龄以36 h为宜.结论 利用优化培养基,在最适条件下培养海洋红酵母Y2,类胡萝卜素产量达到4.97 mg/L,比基础培养基提高了60.32％.     

部分酶解酵母高效电击转化研究

以酵母质粒YCp50为外源DNA,电击转化部分酶解酵母宿主菌AB1380,转化效率稳定在10~6转化子/μg质粒DNA左右,比不酶解酵母或酵母原生质球作受体的电击转化效率高一个数量级以上,也比PEG介导的酵母原生质球转化高3～5倍,而且适合于大片段DNA如水稻YAC分子的转化。达最佳转化时的有关技术参数为:新接菌种通气培养至细胞密度1×10~8～1.5×10~8个/ml;转化时细胞密度控制在1×10~9～1.5×10~9个/ml;每毫升酶解缓冲液加15u溶菌酶(lyticase),30℃下处理酵母5min进行部分酶解;电击时,电场设置在6.25kV/cm、电容25μF,电击后直接铺板。     

HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母的研究

目的:实现HBV PreS1-EGFP融合表达质粒高效转化毕赤氏酵母.方法:分别将乙肝病毒前S1蛋白和绿色荧光蛋白克隆到表达载体pPIC9K,获得重组质粒pPIC9K-EGFP-preS1,Sac1位点酶切线性化,采用醋酸锂(LiAc)和二硫苏糖醇(DDT)对巴斯德毕赤氏酵母Pichia Pastoris GS115预处理,在电压1.5 kv、电容25 F条件下进行电击转化.电击后立即迅速稀释在冰预冷的1 M的山梨醇中,混匀后取100 l的菌液均匀涂布YNBG平板,利用HIS4标记筛选转化子.结果:发现改进后的转化方法pPIC9K-EGFP-preS1的转化率提高到164×10 4个转化子/1μgpPIC9K-EGFP-preS1 DNA,是传统方法的6.6倍.结论:采用改进后的方法能有效的提高质粒pPIC9K-EGFP-preS1的转化率,为筛选高表达HBV PreS-EGFP融合蛋白的转化子打下基础.     

利用PCR方法鉴定甲醇酵母转化子的表型

本文以含外源基因的甲醇酵母表达载体ｐＰＩＣ９／Ｅ２Ｆ－１－ＤＢ质粒ＤＮＡ电转化甲醇酵母ＧＳ１１５,小规模抽提所得转化子的总ＤＮＡ,并以其为模板,以乙醇氧化酶（ＡＯＸ１）５’端序列和３’端的ＴＴ序列为引物,进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物走０．８％Ａｇａｒｏｓｅ电泳,通过对ＰＣＲ产物的电泳带型分析,鉴定出甲醇酵母转化子的表型,即Ｍｕｔ＾＋或Ｍｕｔ＾ｓ。这一鉴定结果为转化子的诱导表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图     

基于网络层次分析法的酵母转化实验策略优化

结合建立的酵母转化实验影响指标体系,利用网络层次分析法(ANP)解决了酵母转化实验策略优化的问题．通过对已有成果进行研究总结,结合前期基础实验以及 对该领域专家学者的咨询意见,建立了酵母转化实验影响指标体系,并基于管理学的ANP理论对实验方法进行了两两比较,分析得出电击穿孔为最优酵母转化方法．实验表明,利用脂质体法得到的转化子为31个/μg质粒DNA,利用电击穿孔法在电压为2.0 kV、1.5 kV时得到的转化子分别为37、29个/μg 质粒DNA,说明电击穿孔实验转化率相对较高,且电压的改变对转化率影响较大,与指标体系分析结果相符．故该指标体系与分析方法可为毕赤酵母转化实验策略优化提供有效的理论依据,其思路、体系、理论和方法可为同类实验所借鉴．     

一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法

目的:建立一种适用于酵母双杂交系统的简便快捷的酵母质粒提取方法。方法:以酿酒酵母为供试材料,用玻璃珠振荡法破除酵母细胞壁,提取酵母总DNA,最后通过电转化大肠杆菌DH10B获得目的质粒。结果:粗提得到的质粒可直接转化DH10B,作为模板用于PCR分析及酵母双杂交后续的序列分析等,大大降低了工作量。结论:该方法简便快捷,经济实用,降低了成本,提高了效率,可以作为一种实验室酵母质粒提取方法。     

适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法

根据最近文献报道的方法,以基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032为宿主,采用E.coli-C.glutamicum穿梭质粒pC2以及可以整合到谷氨酸棒杆菌基因组DNA上的质粒pAK进行电转化条件优化的实验,建立了一种简便的,适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化方法。建立的新方法与原方法相比,细胞预培养时间缩短4h,细胞培养时间缩短1d左右。细胞培养基被简化,不再需要添加进口生化试剂。转化率可达5.5×106cfu／μgDNA,是一种适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.