瑞氏木霉外源基因表达系统中受体菌株的改造

将解除了葡萄糖阻遏的纤维素酶高产菌株瑞氏木霉TrichodermareeseiRutC30经EMS诱变后,在酪蛋白平板上筛选出部分蛋白酶缺陷突变菌株T.reeseiRutC30M3。RutC30M3的胞外蛋白酶活力比亲本株降低约74%,但生长特性、产纤维素酶活力等性状与亲本株相同。用携带潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的表达质粒pAN7-1分别转化瑞氏木霉RutC30和RutC30M3原生质体,转化结果显示RutC30M3(pAN7-1)对潮霉素的抗性比RutC30(pAN7-1)提高约20%,而Northernblot分析结果显示在两菌株中潮霉素基因转录水平相似,由此证明宿主菌蛋白酶缺陷对保护重组蛋白免于降解有明显作用。蛋白酶缺陷菌株RutC30M3适于作为瑞氏木霉外源基因表达系统中的受体菌株用于大量生产同源与异源蛋白。     

产适冷木聚糖酶的海洋产青霉的筛选和诱变

从黄海深层海底泥样中分离到1株产低温木聚糖酶的青霉,经EMS诱变得到11株酶活性提高的菌株,对其中1株产低温木聚糖酶活力最高的菌株产酶性质进行了初步研究。所产木聚糖酶在pH4．6,45℃时酶活可达25．8u／ml,比出发菌株提高126％。诱变后菌株所产木聚糖酶在0℃仍有显著酶活性,达8．2u／ml。     

丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建

采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ (CBHⅠ )启动子和终止子序列 .并以大肠杆菌质粒pUC1 9为骨架 ,在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点 ,构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL .以质粒pAN7 1为模板 ,体外扩增了带有潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的DNA片段 ,将hph插入pTRIL的cbh1启动子和终止子序列之间 ,构建了Pcbh1 hph Tcbh1表达盒 .用此表达盒转化瑞氏木霉C30原生质体 ,在潮霉素平板上得到 1 5株抗性转化子 .对其中的H1转化子进行了PCR和Southern印迹分析 ,证实hph基因确实整合到转化子染色体DNA上 ,并在Pcbh1 启动子控制下进行高效表达 .转化子H1对潮霉素抗性达 1 5 0mg L ,比出发菌株提高 2倍 .瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL的构建成功为开展瑞氏木霉分子生物学研究以及进一步的工程菌株构建工作奠定了基础     

高效的酵母完整细胞转化法

以穿梭质粒PYES2转化酿酒酵母H158,用二硫苏糖醇（DTT）和处理酵母细胞,变性单链鱼精DNA（ssDNA）为质粒DNA的携带体;转化率比普通酵母完整细胞转化法提高200倍,可达8．3×104个转化子/μg质粒DNA。     

产适冷木聚糖酶的海洋产青霉的筛选和诱变

从黄海深层海底泥样中分离到1株产低温木聚糖酶的青霉,经EMS诱变得到11株酶活性提高的菌株,对其中1株产低温木聚糖酶活力最高的菌株产酶性质进行了初步研究。所产木聚糖酶在pH4.6,45℃时酶活可达25.8u/ml,比出发菌株提高126%。诱变后菌株所产木聚糖酶在0℃仍有显著酶活性,达8.2u/ml。