过量表达GhPFN2基因增强棉花对大丽轮枝菌的抗性

越来越多的研究表明,微丝骨架参与植物先天免疫过程,但是其作用机制尚不明确.本研究发现,棉花(Gossypium spp.)的profilin基因(GhPFN2)在大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染条件下表达水平上调,推测GhPFN2可能参与棉花应答黄萎病过程.当棉花根部侵染大丽轮枝菌后,根表皮细胞中微丝的密度和成束度显著增加.与野生型相比,过量表达GhPFN2棉花对黄萎病的耐受性提高,并且棉花根部微丝骨架高级结构与野生型受到大丽轮枝菌侵染后的表型一致.这些结果表明,GhPFN2能够介导微丝骨架的重排,进而参与棉花抵御大丽轮枝菌的侵染过程.     

VIGS技术高通量筛选棉花抗黄萎病相关基因

黄萎病是严重影响棉花生产的一种土传性维管束真菌病害,长期以来,因缺乏行之有效的手段,有关棉花对黄萎病菌抗性分子机制的研究难度很大,进展缓慢.病毒诱导基因沉默(VIGS)这一反向遗传学技术的建立和应用,为研究和阐明棉花基因的功能提供了新的契机.本研究挑选可能与棉花抗黄萎病相关的基因,通过VIGS方法进一步明确和验证这些基因在棉花抗黄萎病菌中的作用.共成功构建了62个基因的VIGS载体,通过重复筛选实验,最终筛选出一些与棉花抗黄萎病相关的基因,其中乙烯信号途径正调控因子EIN2,植物病原应答诱导蛋白基因DIR,木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)被沉默后,沉默棉花植株对黄萎病菌的抗性明显减弱,表明这些基因可能通过不同的信号途径参与棉花对黄萎病菌的抗性.     

棉花NHL基因家族鉴定及黄萎病菌胁迫下的表达分析

已有研究证明拟南芥NHL(NDR1/HIN1-like)基因在抗病中发挥作用。本研究从海岛棉和陆地棉中分别鉴定出100个和118个NHL基因,并对其进行了生物信息学分析。海岛棉和陆地棉NHL基因家族成员几乎遍布各条染色体,并可分为3个亚组,都含有3个与拟南芥保守基序相似的保守结构域。利用接菌后抗病陆地棉品种的转录组数据,分析NHL基因家族各成员表达变化,发现在黄萎病菌胁迫下,有57个陆地棉NHL基因在根和茎中的表达都发生了明显的变化,其表达模式可分为3种类型:接菌前高,接菌后表达下降;接菌前较高,接菌后表达先降后升;接菌前低,接菌后表达升高。第一类基因的表达在接菌后一直受到抑制,推测其在棉花抗黄萎病反应中受到负调控;后两类基因受黄萎病菌诱导表达升高,推测其在棉花抗病中受到正调控。本研究结果为分析成员较多的NHL基因家族在棉花抗黄萎病中的作用提供了理论依据。     

陆地棉抗黄萎病基因的分子标记定位

棉花黄萎病是棉花生长过程中最具破坏力的病害之一,在世界范围内流行.棉花黄萎病已成为棉花生产中的主要障碍.减轻棉花黄萎病损失最为经济、安全、有效的办法就是培育和推广抗病品种.本研究利用抗黄萎病品系60182和感黄萎病品种军棉1号为亲本配制杂交组合,对陆地棉抗黄萎病性状进行遗传分析和抗病基因分子标记定位.用主基因＋多基因混合遗传模型和P1,P2,F1,B1,B2和F2六世代联合分析的方法对病叶比例性状进行遗传分析.结果表明,接种BP2,VD8,T9和三者等浓度混合病菌时,抗病性都受两对加性-显性-上位性主基因控制,陆地棉60182的抗病性在各个分离世代都以主基因遗传为主.运用F2为作图群体构建了一个含139个标记位点,31个连锁群,总长1165cM的分子标记连锁遗传图谱,标记平均距离为8.38cM,覆盖棉花全基因组的25.89%.调查229个F2：3家系各时期平均病级代表F2单株抗病性,结合连锁遗传图谱,复合区间作图检测QTL.结果显示,在60182上,接种BP2时检测到4个QTL位于D7染色体上,4个QTL位于D9染色体上;接种VD8时,有5个QTL位于D7染色体上,9个QTL位于D9染色体上;接种T9时,有4个QTL位于D7染色体上,5个QTL位于D9染色体上;接种混合病菌时,有3个QTL位于D7染色体上,7个QTL位于D9染色体上.60182在不同调查时期对4种黄萎病菌的抗性QTL都集中在D7、D9两条染色体上,形成两个明显的抗病QTL集中区.这一结果与两对主基因的遗传模式相吻合,充分表明陆地棉抗黄萎病品系60182兼具对落叶型,非落叶型黄萎病菌的广谱抗性.同时与陆地棉抗黄萎病QTL连锁的分子标记可加速抗黄萎病基因的应用,为培育稳定高抗黄萎病新材料提供有价值的理论依据.     

基因沉默技术在抗真菌病害中的应用和展望

真菌病害严重威胁作物的产量和品质,给国家和人民造成巨大的经济损失。尤其是引起维管束病害的土传真菌,化学农药的作用效果很不理想。利用抗性基因进行遗传育种是目前生物防治的重要手段之一,但对于缺乏抗性资源的物种,面对强大的土壤真菌病害,研究者也时常束手无策。近年来,利用RNA干扰技术发展而来的宿主诱导的基因沉默(Host induced gene silencing,HIGS)策略,在抗病虫害领域逐渐崭露头角,但由于真菌侵染的复杂多样性及土壤传播的特性,HIGS在土壤真菌病害中的应用充满神秘和挑战。本研究室近期揭示了棉花黄萎病(一种严重的土壤真菌病害)的"罪魁祸首"——大丽轮枝菌的侵染结构和侵染过程;并首次证明了宿主植物内源小RNA能够跨界进入病原菌细胞中降解致病基因表达的抗病作用;在此基础上,本研究室利用HIGS在棉花上获得了对黄萎病抗性较高的品系,成功地开辟了抗土壤黄萎真菌病害的新天地,研究结果显示出基因沉默技术在这一领域强大的应用潜力和前景。     

大丽轮枝菌甘油-3-磷酸脱氢酶的功能分析

大丽轮枝菌可侵染棉花、马铃薯、番茄等660余种寄主植物,引致黄萎病,造成严重的经济损失.为了深入了解大丽轮枝菌的致病机制,本研究在前期棉花提取物诱导大丽轮枝菌转录组分析的基础上,选择上调差异表达的线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶基因VdGut2 (VD592_6958_Chr4)和非差异表达的胞质甘油-3-磷酸脱氢酶基因Vd...     

根系土壤假丝酵母菌Candida sp. YIN9对大丽轮枝菌和全齿复活线虫的抑制作用

[目的] 研究黄萎病抗性棉(海 7124)根际土壤中酵母菌株对棉花黄萎病病原真菌大丽轮枝菌和全齿复活线虫的拮抗效果,为生物防治棉花黄萎病和全齿复活线虫提供理论依据。[方法] 通过镜检、糖发酵实验、碳源同化实验、26S rRNA测序对菌株的形态、生理生化特征及其系统发育关系进行鉴定,并利用七叶苷筛选、刚果红染色、平皿对峙实验、盆栽实验、平板生测实验测试其产酶活性以及抑制大丽轮枝菌和杀线虫活性。[结果] 从大批黄萎病抗性棉(海 7124)根际土壤中筛选出编号为YIN9的酵母菌菌株,分类鉴定结果表明:YIN9菌株属于假丝酵母属Candida。平皿对峙实验结果表明:菌株YIN9对大丽轮枝菌的抑菌率达59%;将菌株YIN9的无菌发酵滤液与大丽轮枝菌孢子共培养12 h后镜检发现,用菌株YIN9处理的实验组,大部分棉花黄萎病病菌孢子不能正常萌发。盆栽实验结果表明:菌株YIN9对棉花黄萎病的平均防治效果为60.02%,可以显著降低感病棉棉花黄萎病的发病率和病情指数。此外,与从黄萎病抗性棉根际土壤中筛选获得的其他酵母菌株相比,菌株YIN9具备较高的杀线虫活性:菌株作用全齿复活线虫48 和60 h后,线虫死亡率分别为90%和100%。将菌株YIN9发酵液煮沸后,其抑制大丽轮枝菌和杀线虫活性均急剧下降,进一步测试发现,该菌株拥有较高的蛋白酶和纤维素酶活性。[结论] YIN9中的生防因子可能是热不稳定性物质,具备较高的杀线虫活性,可以显著提高感病棉对黄萎病的抗性。     

大丽轮枝菌毒素的多糖组份对棉花致萎作用的研究

用β-葡萄糖苷酶水解大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)毒素中的多糖组份。发现经酶处理后的5个不同致病力类型的棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌)菌株毒素都不能影响整个毒素复合物对棉花的致萎作用,表明毒素中的多糖组份在棉花的致萎作用中不占有重量地位。     

转导外源总DNA培育棉花抗病新品种简报

棉花黄萎病是真菌病害,病原菌为大丽轮枝菌(Vertillium daliae),因致病力不同可分为不同的致病类型或生理小种。据统计,黄萎病对棉花的危害有逐年加重的趋势。1993年是我国棉花黄萎病大发生的一年,发病面积约占全国棉田的一半以上。尤其是北方棉区受害更重,重病棉田棉花病株率在80%以上,其中落叶成光秆的病株率高达50%,损失皮棉达1亿公斤。新疆棉区由于种植面积不断扩大(2000年皮棉总产占全国的1/3以上),引种不规范和     

香蕉抗病种质NBS类RGAs的克隆及相关序列差异分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料GCTCV-119的基因组DNA及cDNA中扩增获得9个DNA片段和10条cDNA片段,均编码为通读的氨基酸序列,命名为"BR-1"-"BR-19",GenBank登录号依次为EF515833-EF515836, EU123871-EU123885。同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop(Kinase-1a)、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因。其中,BR-5和BR-6与番茄抗镰刀菌枯萎病番茄专化型I2、I2-1和I2-2基因聚为一类,可能与香蕉镰刀菌枯萎病的抗性相关。     

硬粒小麦-粗山羊草双二倍体白粉病抗性的遗传分析与基因推导

对99份硬粒小麦-粗山羊双二倍体用北京地区流行的5号白粉菌生理小种进行了白粉病抗性鉴定,筛选出11个苗期抗病的双二倍体材料和2个全生育期抗病的材料M53和M81。对M53和M81及其硬粒小麦和粗山羊草亲本进行的抗白粉病鉴定结果表明,其抗性来源于粗山羊草。与M53和M81具有相同硬粒小麦亲本、不同粗山羊草亲本双二倍体的抗性结果也表明抗性基因来源于粗山羊草。对M53和M81的抗性遗传分析表明,它们均携带1个单显性抗病基因。用14个白粉菌生理小种对已知抗病基因品系与M53和M81两份待测材料进行接种鉴定,结果表明,M53和M81与已知基因的抗菌谱均不相同,M53与M81的抗菌谱也不相同,说明M53和M81各自分别携带1个新的显性抗白粉病基因。     

陆地棉GhSUMO基因的克隆与黄萎病菌诱导表达分析

SUMO化修饰与植物抗病防御、信号转导和耐旱等有着直接的关系.本文以抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术获得SUMO的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和电子克隆,获得了全长为396 bp的SUMO基因编码区cDNA全长,我们将该基因命名为GhSUMO,推测该基因编码95个氨基酸.分别以抗黄萎病陆地棉品种豫棉21号的cDNA和DNA为模板,对该基因进行了PCR扩增验证,测序结果表明,GhSUMO基因序列与电子克隆序列一致,且没有内含子.蛋白序列分析表明,该蛋白具有保守泛素结构域和C端双Gly的断裂/连接位点,以及保守的疏水表面和Ulp1-Smt3互作位点.系统进化分析表明,该蛋白与蓖麻的同源序列表现了最高的相似性,与其它双子叶植物同源序列次之,而与单子叶植物的相似性较低.棉苗接菌后实时定量PCR结果显示,该基因表达量在接黄萎病菌的量48 h后明显上调,96 h达到未接菌对照的5倍以上.GhSUMO基因可受黄萎病菌诱导表达,表明该基因在陆地棉抗黄萎病的机制中可能发挥重要作用.     

棉花黄萎病病原菌诱导侵染对转基因抗病棉花生理性状的影响

通过研究棉花黄萎病病原菌诱导侵染对转基因抗病棉花生理性状的影响,旨在为提高转基因抗病棉花抗病性提供理论依据。Byd、28p两品种棉花为供试材料,应用花粉管通道法将几丁质酶与β-1,3-葡聚糖双价抗病基因导入棉花株系中,多年筛选获得不同抗性水平的棉花株系;棉种经棉花黄萎病病菌侵染后,苗期测定棉株内的生理生化变化。结果显示,转基因抗病棉株体内的酶活性已达对照水平,而感病及耐病棉株内的酶活性均有不同程度的变化。所测定的棉株内的酶活性及脯氨酸含量的变化与棉株的抗病性相关。     

4个太湖流域粳稻地方品种抗稻瘟病性的遗传分析

以太湖流域粳稻地方品种薄稻、铁杆青、江南晚和缺儿糯等广谱、高抗稻瘟病为材料, 与高感稻瘟病品种苏御糯杂交, 获得杂交F1、F2 , 分别接种日本稻瘟病鉴别菌系北1和中国稻瘟病菌生理小种ZE3、ZG1, 根据P1、P2、F1和F2等不同世代植株的抗、感反应, 分析地方品种对不同稻瘟病菌生理小种(菌系)的抗性遗传机理。结果表明: 薄稻、铁杆青及缺儿糯对北1菌系的抗性均可能由一对显性基因控制, 江南晚对北1的抗性则可能由两对抑制基因互作控制; 铁杆青及缺儿糯对ZE3小种的抗性均可能由一对显性基因控制, 薄稻和江南晚对ZE3小种的抗性可能分别由两对显性基因和两对抑制基因互作控制; 铁杆青对ZG1小种的抗性可能是由一对显性主基因控制, 薄稻和江南晚对ZG1小种的抗性则可能由两对抑制基因互作控制。进一步将薄稻与12个日本稻瘟病菌鉴别品种杂交,用北1菌系接种不同组合的F1和F2 , 进行抗病基因的等位性测定。结果表明, 薄稻对北1菌系的抗性基因与12个鉴别品种所携带的已知抗稻瘟病基因是不等位, 将该基因暂定为Pi-bd1(t)。     

海岛棉GbHyPRP1克隆及其转基因拟南芥抗黄萎病验证

在对黄萎病菌胁迫处理的海岛棉Pima 90-53根组织全长c DNA文库分析中,筛选到一个与黄萎病胁迫相关的杂合富含脯氨酸蛋白(hybrid proline-rich protein)基因,将其命名为Gb Hy PRP1。该基因c DNA序列全长1747 bp,开放阅读框945 bp,编码一个由314个氨基酸残基组成的蛋白,包含信号肽、N端富含脯氨酸域及C端Pollen Ole e I域。同源序列分析显示,Gb Hy PRP1与来自雷蒙德氏棉、陆地棉和亚洲棉的Hy PRP1蛋白序列相似性最高,分别为95.95%、93.87%和91.34%。q RT-PCR分析结果显示,受黄萎病菌胁迫后海岛棉根部Gb Hy PRP1表达显著下调。将Gb Hy PRP1基因克隆至植物超表达载体,农杆菌介导转化拟南芥获得转基因植株。病指统计分析表明Gb Hy PRP1过量表达显著降低了拟南芥对黄萎病的抗性。据此推测Gb Hy PRP1参与棉花抗黄萎病,可能是一个重要的负调控因子。     

棉花赤霉素氧化酶同源基因GhGA20ox1在烟草中的功能表达

为研究棉花GA20-氧化酶同源基因GhGA20ox1的功能,将该基因转入本明烟（N．benthamiana）中进行超量表达。RT-PCR分析表明GhGA20ox1基因在转基因植株中得到了不同水平的表达。GhGA20ox1基因的超量表达促进了本明烟中的GA4＋7合成,并导致赤霉素过量的表型出现。转基因本明烟的表型变化程度与GhGA20ox1基因的表达水平和GA4＋7的含量一致。这些结果表明,GhGA20ox1基因编码一个有功能的GA20-氧化酶,能够在转基因烟草中促进活性GA（GA4＋7）的合成,可以用作目的基因来提高棉花纤维和其他植物的内源GA水平。     

大丽轮枝菌假定蛋白VDAG＿07165的功能

土传病原真菌大丽轮枝菌寄主范围广,引起的黄萎病危害程度重、防控难度大。对病菌重要致病蛋白的挖掘和功能研究有望为病害防治提供新思路。本研究通过前期蛋白质组测序鉴定到一个未知功能结构域DUF1620家族蛋白VDAG＿07165在大丽轮枝菌对马铃薯根部初侵染阶段高表达。缺失VDAG＿07165基因导致大丽轮枝菌产孢量、分生孢子萌发率和穿透力均显著降低,对马铃薯植株的致病力显著减弱。由此说明,假定蛋白VDAG＿07165可在侵染早期通过调控大丽轮枝菌分生孢子的产生、萌发和穿透能力参与该菌对寄主的致病过程。本研究首次探明了DUF1620家族蛋白在土传病原真菌大丽轮枝菌分生孢子产生和侵染中的作用,为挖掘未知功能的新基因及其在真菌发育和致病过程中的功能研究提供了借鉴和参考。     

MAPK基因家族成员在棉花抗黄萎病中的功能分析

作为植物中普遍存在的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶信号传导系统,促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号传导途径,在调控植物生长发育,传导并响应各类生物和非生物逆境信号胁迫过程中都起着重要作用.鉴于对棉花(Gossypium hirsutum L.)MAPKs级联信号传导系统中最下游的激酶MAPK家族成员缺乏了解,更不明楚MAPK基因家族成员在棉花抗黄萎病中的功能和作用.本文利用已公布的雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)和亚洲棉(Gossypium arboreum)基因组数据,并从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中收集陆地棉的MAPK氨基酸序列,成功地对棉花MAPK基因家族成员进行了同源分析和聚类.结果显示,棉花MAPK基因家族各成员均具有特征性TEY磷酸化位点或TDY磷酸化位点结构特征,依据其蛋白序列可划分为A,B,C和D 4个族.进而从以上各族中分别选择两个MAPK基因成员,利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术,来研究MAPK基因家族成员在棉花抗黄萎病中的作用.结果发现,6个MAPK基因家族成员参与了棉花对黄萎病菌的抗性作用,这提示MAPKs级联信号传导途径是参与棉花抗黄萎病信号传导通路之一.     

利用KASP标记筛选含rhg1和Rhg4位点的大豆抗病资源

大豆胞囊线虫(SCN,soybean cyst nematode)病是一种世界性大豆病害,培育抗SCN大豆品种是防治SCN的重要措施。本研究利用来自抗SCN主效位点rhg1和Rhg4的2个KASP标记,对487份大豆材料进行筛选,选择含有抗性位点且农艺性状优异的材料;通过室内接种大豆胞囊线虫2号、4号、5号生理小种和新小种X12,进行抗性鉴定验证其抗性水平,为培育抗病品种提供抗源材料。标记筛选结果表明,20份材料含有rhg1和Rhg4这2个主效抗性位点,其中,2份材料仅含有Rhg4位点。表型抗性鉴定结果表明,在接种的22份材料中,有1份材料对3个小种表现中抗,5份材料对2个小种表现抗或中抗。其中,1份材料对2号小种表现抗病、4份表现中抗;2份材料对4号小种表现中抗;4份材料对5号小种表现抗病、14份表现中抗;22份材料对新小种X12均表现出感病或中感。因此,本研究从487份材料中筛选出20份含有2个SCN抗性位点并具优异农艺性状的材料,可通过rhg1和Rhg4位点的累加培育抗病品种。     

硬粒小麦—粗山羊草双二倍体白粉病抗性的遗传分析与基因推导

对９９份硬粒小麦－粗山羊草双二倍体用北京地区流行的１５号粉菌生理小种进行了白粉病抗性鉴定,筛选出１１个苗期抗病的双二倍体材料和２个全生育期抗病的材料Ｍ５３和Ｍ８１。对53几Ｍ８１及其硬粒小麦和粗山羊草亲本进行的抗白粉病鉴定结果表明,其抗性来源于粗山羊草,与Ｍ５３和Ｍ８１具有相同硬粒小麦亲本、不同粗山羊草亲本双二倍体的抗性结果也表明抗性基因来源于粗山羊草,对Ｍ５３和Ｍ８１的抗性遗传分析表明,它们均携带１个单显性抗病基因,用１４个白粉菌生理小种对已知抗病基因品系与Ｍ５３和Ｍ８１两份待测材料进行接种鉴定,结果表明,Ｍ５３和Ｍ８１与已知基因的抗菌谱均不相同,Ｍ５３与Ｍ８１的抗菌谱也不相同,说明Ｍ５３和Ｍ８１各自分别携带１个新的显抗性白粉病基因。