L-丙氨酸对小鼠胰岛分泌胰岛素的急性作用及其葡萄糖依赖性研究

探讨L-丙氨酸刺激小鼠胰岛分泌胰岛素的剂量和葡萄糖依赖性。雌性6~10周NMRI小鼠,苯巴比妥腹腔麻醉,应用胶原酶技术消化胰腺分离胰岛,置于RPMI1640培养皿中在37℃培养箱(5%CO2,95%空气)过夜培养。次日在Krebs-Ringer缓冲液中37℃水浴培养箱预培养30 min,分别把单个胰岛小心放入100 L含有不同浓度葡萄糖和不同浓度L-丙氨酸的改良Krebs-Ringer缓冲液37℃水浴培养箱培养60 min,留取50 L上清液进行胰岛素测定。结果:L-丙氨酸在0.1~20mmol.L-1范围促进了葡萄糖刺激的小鼠胰岛的胰岛素分泌,随剂量增大而增强,在低浓度葡萄糖存在的条件下,10 mmol.L-1L-丙氨酸不能刺激小鼠胰岛的胰岛素分泌,在6.7 mmol.L-1及以上葡萄糖存在的条件下,L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素。本研究显示L-丙氨酸能增加葡萄糖诱导的小鼠胰岛分泌胰岛素,此作用依赖于一定水平葡萄糖的存在。     

大鼠胰岛分离条件的优化

目的:优化大鼠胰岛分离纯化的条件,为胰岛移植实验奠定基础。方法:通过胆总管灌注胶原酶P来消化大鼠胰腺,分离胰岛,采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛,观察胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重对胰岛分离结果的影响。双硫腙染色鉴定胰岛,丫啶橙/碘丙啶染色鉴定胰岛细胞活率,糖刺激胰岛素释放试验评价胰岛功能。结果:胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重对胰岛分离结果有重要影响。1mg/ml胶原酶P在37℃静止消化45分钟条件下,胰岛分离效果最佳,效果较其他酶浓度和消化时间条件下好(P＜0．05)。体重350g的大鼠的胰岛收获量778．33±80．21IEQ/胰腺,而体重250g的大鼠的胰岛收获量655．00±56．56 IEQ/胰腺(P＜0．05)。优化条件下分离的胰岛其纯度＞90%,胰岛细胞活率＞90%,低糖(2．8mmol/L)、高糖(16．7mmol/L)刺激胰岛素释放分别为(5．40±1．75)mIU/L/30IEQ,(12．27±2．55)mIU/L/30IEQ(P＜0．05),刺激指数为2．33±0．29。结论:胶原酶浓度、消化时间以及大鼠体重影响胰岛分离结果,优化分离条件可改善大鼠胰岛分离结果。     

一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法

采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.     

青龙木制剂对小鼠胰腺β细胞单位电活动的影响

目的:观察青龙木制剂(Ambyna preparation)对小鼠胰岛β细胞单位放电的影响,探讨青龙木制剂促进胰岛素分泌的机制.方法:以大于刺激阁以上(＞5mmol/L)的葡萄糖滴注在体小鼠胰腺上诱发胰岛β细胞电活动,用玻璃微电极记录在体小鼠胰岛β细胞的单位放电.结果:青龙木制剂和格列本脲一样加强葡萄糖诱导的胰岛β细胞电活动.结论:青龙木制剂加强葡萄糖诱导的胰岛β细胞电活动进而促进胰岛素的分泌.     

沉默长链非编码RNA Meg3损伤小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌功能

MEG3是一种长链非编码RNA。已有研究证明,鼠源Meg3参与小鼠诱导多能干细胞、神经元和视网膜的分化过程。最新报道,MEG3在人胰岛β细胞中高表达,但其对维持成年胰岛β细胞的功能尚不清楚。本研究旨在探讨Meg3在小鼠胰岛细胞胰岛素分泌功能中的作用。实时定量PCR揭示,与Balb/c小鼠心、肝、脾、肺、肌、肾等组织/器官比较,Meg3在胰腺组织中高表达。在非糖尿病小鼠发生自发性糖尿病的第8、12周,Meg3在胰岛中的表达水平分别下调24%±8%和29%±9% (P<0.01);而当血糖升高20 mmol/L,小鼠胰岛中Meg3表达下调72%±16%(P<0.01)。在MIN6细胞中采用RNA干扰敲减Meg3的表达,在高糖浓度（20 mmol/L）刺激条件下,胰岛素分泌显著减少。小鼠静脉注射siRNA,结合血糖测定或葡萄糖耐受试验（IPGTT）显示,si-Meg3小鼠血清胰岛素水平显著下降。注射葡萄糖前血糖升高,注射葡萄糖后耐受能力降低;免疫组化分析显示,si-Meg3小鼠胰岛素阳性细胞的面积减少。实验结果提示,Meg3通过参与胰岛素的合成和分泌维持成年小鼠胰岛功能。Meg3表达失调可能参与I型糖尿病（T1DM）发病过程。     

SD大鼠原代胰岛细胞分离、纯化及培养技术的改进

目的:探讨大鼠胰岛细胞分离、纯化及培养的方法,并评价其生物学功能。方法:选用8~10周龄健康SD大鼠,采用胆总管逆行注射预冷胶原酶P溶液,37℃水浴静止消化,30目不锈钢筛网过滤,Ficoll400非连续密度梯度离心纯化。分离后的胰岛用DTZ染色计算胰岛产量,胰岛素释放试验评价其生物学功能。结果:胰岛细胞分布于Ficoll400浓度为23%~20%和20%~11%的界面之间。DTZ染色呈红色细胞团,胰岛产量为(606±56)IEQ/胰腺。纯度高达80~90%,活率≥90%,胰岛素释放功能良好。结论:胶原酶P溶液原位消化,Ficoll400纯化是一种高效简便的胰岛分离方法,分离的胰岛细胞数量多、纯度高及活性好。     

两种培养液对小鼠胰岛细胞培养后的形态和功能的影响

目的:考察两种胰岛细胞培养液对小鼠胰岛细胞培养后的细胞形态和功能的影响。方法:分别以RPMI1640和低糖型DMEM为基础配制两种胰岛细胞培养液,与小鼠胰岛细胞共培养24 h,用FD-PI染色观察胰岛活性,透射电镜观察胰岛细胞内部形态,并用连续葡萄糖灌流刺激试验考察胰岛素释放功能。结果:两种胰岛细胞培养液24h内对培养的胰岛活性影响无差异,但透射电镜结果显示以低糖型DMEM为基础的培养液培养的胰岛细胞间隙较小,且葡萄糖灌流结果显示其培养的胰岛细胞后续胰岛素分泌能力显著增加。结论:以低糖型DMEM为基础配制的胰岛细胞培养液能较好地保持培养胰岛的结构和功能。     

NOD小鼠胰岛的分离及其在体内外的生物学特性

目的 建立分离纯化非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠胰岛的方法,并对其体内外生物学特性进行研究。方法 采用改良的胶原酶消化结合Ficoll密度梯度离心方法,分离纯化NOD小鼠胰岛。应用体外糖刺激实验检测分离纯化的胰岛功能,以及通过监测移植小鼠的血糖、体重变化及糖耐量实验对移植胰岛的体内生物学功能进行分析,并通过HE染色和免疫荧光染色检测肾被膜下移植胰岛的存活情况。结果 胰岛产率为(116±12)个胰岛/胰腺,纯度90%。体外糖刺激实验结果显示,NOD小鼠胰岛的糖刺激胰岛素释放水平明显低于KM小鼠胰岛。胰岛移植实验显示,移植胰岛能有效改善糖尿病小鼠的血糖、体重和糖耐量,但改善作用一般仅能维持2周左右。HE染色和免疫荧光染色结果显示,肾被膜下可见胰岛素阳性的胰岛细胞团,并且在残存的移植胰岛细胞团周围存在大量淋巴细胞浸润。结论 通过改良的小鼠胰岛分离方法可由NOD小鼠分离得到大量较高纯度的胰岛,可用于今后探索如何阻断自身免疫损伤保护移植胰岛的研究。     

胶原酶消化法分离制备罗非鱼和中华鳖的胰岛细胞及其生物活性

目的探讨罗非鱼、中华鳖胰岛细胞分离提取的方法及对比两者的生物学活性差异。方法采用胶原酶消化分离罗非鱼、中华鳖胰岛细胞,光镜下观察其形态结构。在体外用不同浓度的葡萄糖刺激胰岛细胞,测定其生物学活性。结果罗非鱼、中华鳖胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激具有明确的生物学反应,并随着葡萄糖浓度的增加胰岛素的产生也相应增加。结论采用胶原酶消化分离罗非鱼、中华鳖胰岛细胞的方法可行,胰岛细胞在体外对不同浓度的葡萄糖刺激产生胰岛素并具有正相关,其为鱼纲、爬行纲与哺乳纲动物之间的胰岛细胞移植奠定了实验基础。     

INS-1E细胞葡萄糖毒性模型的建立

目的:建立胰岛细胞系INS-1E细胞的葡萄糖毒性模型。方法:将INS-1E细胞分别在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L、16.7mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)的1640完全培养基中培养不同时间(48 h、72 h、96 h、120 h),分别在不同时间点取细胞进行细胞功能检测,实时荧光定量PCR法检测胰岛素m RNA的表达,ELISA检测葡萄糖刺激的胰岛素的分泌。结果:与对照组相比,高糖浓度(5.5 mmol/L、16.7 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L)培养基中培养48 h后,INS-1E细胞的胰岛素合成和分泌的功能均增加(P均0.05),随着培养基中葡萄糖浓度的升高以及培养时间的延长,INS-1E细胞胰岛素合成及分泌的功能逐渐下降,当在葡萄糖浓度为30 mmol/L的培养基中培养120 h后,胰岛素m RNA合成及葡萄糖刺激的胰岛素分泌均显著降低(P均0.01)。结论:INS-1E细胞在30 m M的葡萄糖中培养120 h形成稳定的葡萄糖毒性模型。