硝酸还原酶的研究——Ⅲ.硝酸还原酶钝化蛋白的专一性及其对硝酸还原酶的水解作用

以同样的提取方法,分别从小麦叶片、曼陀罗愈伤组织中提取的硝酸还原酶(NR)钝化蛋白均可明显钝化小麦、水稻、玉米等叶片的NR,而从水稻、豌豆叶片中提取的NR钝化蛋白也均可明显钝化小麦叶片NR的事实显示出植物体内NR钝化蛋白存在的普遍性及不同植物种间这种钝化蛋白作用的共同性。水稻叶片及曼陀罗愈伤组织NR钝化蛋白只能钝化NR,而不能钝化与NR同为植物氮素同化关键酶的亚硝酸还原酶(NiR),小麦叶片NR钝化蛋白只能钝化NR而不能钝化与NR同为诱导酶的α-淀粉酶又表明NR钝化蛋白对NR的钝化作用具有一定的专一性。在小麦叶片NR钝化蛋白(部分Ⅰ)与NR一起保温时,同时加入作为水解酶抑制剂的大豆胰蛋白酶抑制物或丝氨酸酶抑制物PMSF,均可部分解除钝化蛋白的钝化效力,可作为此种钝化蛋白是个水解酶的进一步证明。     

番茄叶片中硝酸还原酶(E.C.1.6.6.2)活性稳定因子的研究

经过硫酸铵(完全饱和度)沉淀、离心(16000×g)、沸水处理、Sephadex G-75、DEAE-52层析、透析等步序,从番茄叶片中分离出了 NR 活性稳定因子,电泳后,经氨基黑染色,凝胶柱上只显示一条谱带,证明稳定因子是蛋白类物质。在60℃以下的不同水温中,稳定因子都显著地稳定和增进了番茄叶片中的 NR 活性,不同程度地避免了温度对 NR 活性的钝化影响。在体外,稳定因子能显著延缓小麦幼苗中 NR 活性,NR 在0℃保存至第9天,仍具有较高活性。在提取过程中,经热处理或始终在4℃以下低温提取的稳定因子,对 NR 活性都有稳定作用。分析其蛋白的磺基丙氨酸量,发现比另一种蛋白的高4倍以上,说明其蛋白含有较多的二硫键,是其耐热性的原因。番茄叶片中的稳定因子是一种分子量小的蛋白类物质,在叶片中有两种形式存在,一种是与大分子的蛋白质结合一起;另一种是单独存在。热处理能使它与蛋白质分开,有助于获得纯度高的稳定因子。该因子不是 FAD、血品质、脯氨酸一类物质。这些物质使 NR活性稳定的作用不明显。     

硝酸还原酶的研究——Ⅵ.水稻硝酸还原酶的纯化和特性

水稻叶片NR在Blue Dextran-Sepharose 4 B亲和层析法的纯化过程中,继100μMNADH洗脱出现一个酶活峰后,再用0.25MKNO_3洗脱又出现一个更高的酶活峰。酶与BlueDextran-Sepharose 4B有两个结合位点,它们可能就是酶与底物NADH和NO_3的结合位点。NADH能和Blue Dextran竞争与酶结合而把NR从亲和柱上洗脱下来。硝酸盐除了具一般盐类的离子强度外,还有明显的底物效应。如果将KNO_3-洗脱的NR再反复进行亲和层析,又可得到NADH-洗脱和KNO_3-洗脱的两部分NR。这两部分NR在聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上都呈现一条相同的蛋白带。 水稻NR的全酶分子量约330Kd,亚基分子量约57Kd,故全酶可能由6个相同亚基组成,酶活的pH范围为6.5～8.5,最适pH为7.5;酶对底物NO_3-和NADH的K_m值分别为3.3×10~(-4)M和2.9×10~(-5)M。     

内外生理条件对小麦黄化幼苗叶片亚硝酸还原酶活力的影响

小麦黄化幼苗叶片的亚硝酸还原酶(NiR)是诱导酶,其活力受光照,诱导物浓度、pH、苗龄、激素等内、外因素的影响。6-BA明显促进NiR活力,钨酸钠和硝酸还原酶(NR)钝化蛋白不抑制NiR活力,表明在体内亚硝酸还原酶活力的变化是由环境因素调节的。     

土曲霉金色变种AT8951菊粉酶的纯化和性质的研究

土典霉金色变种AT8951菊粉酶粗酶液经硫酸铵分段沉淀、DEAE Cellulose DE32离子交换、超滤、Sephadex G-150凝胶过滤和FPLC,获得两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ,经分析型FPLG和PAGE鉴定为单一纯和分析纯。EⅠ分子量为66KD,最适作用温度和pH分别55℃和5.8;EⅡ分子量为56KD,最适作用温度为57℃,最适pH为6.0。EⅠ和EⅡ皆为糖蛋白,多糖含量分别为24.7％和22％,都属于内切酶。本文还对EⅠ和EⅡ的Km值和I/s值,温度、pH、离子对酶活作用的影响等进行了研究。     

番茄叶片中硝酸还原酶活性的“稳定因素”

硝酸还原酶(NR)是一种不稳定的酶,离体的NR在0℃下保藏几小时后,它的活性会显著丧失,有时甚至测不出它的活性。这一情况一直是进一步研究NR的生理生化的主要障碍。1979年,Sharrad首先发现小麦叶片中有二种因素能增进 NR活性,他认为这二种因素可能是蛋白类物质。我们(1980)证实番茄叶片中也有蛋白类物质能活化脱辅基NR酶蛋白。Purvis(1980)发现棉花种子及子叶中有一类热稳定的蛋白类物质,能稳定NR活性。现在对这类物质的认识刚刚开始,对它的性质和在植物之间的分布有待进一步研究。     

茶树硝酸还原酶基因克隆及表达分析

利用茶树全器官转录组文库中硝酸还原酶(NR)的EST,通过RACE技术扩增出NR基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了NR基因在不同茶树品种中的表达。结果表明:NR基因cDNA全长2 927bp,开放阅读框2 652bp,编码一个有884个氨基酸蛋白质,GenBank登录号为JX987133。经BlastX比对,与GenBank中登录的烟草NR相似性达到74%。茶树NR蛋白属于亲水性蛋白,可能为胞质蛋白。25个茶树品种叶片中NR表达水平差异明显,最高值是最低值的22.75倍。因NR是植物氮代谢过程中的关键限速酶,推测25个茶树品种间氮吸收利用能力存在差异。     

低pH对水稻黄化叶片硝酸还原酶活性暗诱导的调节

在低pH条件下,水稻离体黄化叶片的硝酸还原酶(NR)活性能在暗中诱导产生,其诱导过程约有2h的滞后期,亚胺环已酮(CHI,5ppm)和Na_2WO_4(25 mmol/L)能完全抑制这种诱导作用。在最适pH 3.0时,H~3标记氨基酸掺入NR的量比pH 7.0时约高2倍,表明酶活性的产生与酶蛋白的重新合成有关。 当低pH暗诱导时,BA(5ppm)和ABA(15ppm)能使酶活性分别提高约30％和80％,但它们都不能取代低pH在NR活性暗诱导中的作用。当存在1ppm CHI的时候,BA仍促进NR活性,而ABA则加强CHI对酶活性的抑制作用,这提示BA与ABA在低pH暗诱导条件下促进NR活性的机制是不同的。在pH 7.0的光诱导条件下,ABA对NR活性起抑制作用。     

硝酸还原酶的研究——Ⅳ.NADH对小麦硝酸还原酶的钝化作用

不同浓度的NADH(0.5～4mM)与硝酸还原酶(NR)在不同温度下(0～20℃)一起预保温,均可看到NADH对NR的钝化作用。KCN也抑制NR活性。NADH和KCN同时存在能强烈地协同钝化NR。连二亚硫酸钠也能与KCN协同钝化NR。这种协同钝化作用可被铁氰化钾逆转。在亲合层析纯化的NR上可看到同样的可逆钝化现象,表明NR的氧化还原状态调节NR的活性。     

小麦老化叶片蛋白水解酶的某些生化特性的研究（简报）

小麦叶片蛋白水解酶最适pH为5．0左右;最适温度：扬麦五号品种为50℃,野生一粒为45℃。碘乙酸、苯甲基磺酰氟明显抑制蛋白水解酶活力,前者大于后者;而半胱氨酸明显激活其活性。对小麦老化叶片起主要作用的是巯基类蛋白水解酶,丝氨酸蛋白酶也起一定作用。     

斑玉蕈酸性磷酸酯酶的酶学性质研究

以斑玉蕈为材料分别从菌盖和菌柄中提取一种酸性磷酸酯酶（ACPase,EC.3.1.3.2）,进一步用硫酸铵沉淀分离,Sephadex G-200柱纯化,从菌盖中分离到3个酶组分,从菌柄中分离到4个酶组分,分别对菌盖和菌柄的酶Ⅰ和酶Ⅰ′进行聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳纯度鉴定,均呈现单一酶蛋白带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定酶Ⅰ和酶Ⅰ′的相对分子量均为65kDa,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Sephadex G-75凝胶过滤测定分析,酶Ⅰ和酶Ⅰ′均为单亚基蛋白。紫外吸收光谱（UV）测     

硝酸还原酶的研究——Ⅱ.6-BA和光对小麦硝酸还原酶诱导的影响

黄化麦苗在暗中不能由NO_2~-诱导产生NR,而生长在水中的黄化麦苗经6小时以上的预照光,则可在随后的暗期中由NO_3~-诱导产生高活性的NR。白光、红光和远红光的短暂照光,不能使麦苗获得在暗中由NO_3~-诱导高活性NR的能力。无论在诱导介质或非诱导介质中,这种诱导能力在暗中都逐渐消失。DCMU可部分抑制黄化麦苗NR的光下诱导。预照光后植株的NR暗诱导被砷酸钠抑制。葡萄糖能促进离体黄化叶片在暗中诱导形成高于对照的酶活性。预照光通过光合产物为NR合成提供能量,可能是使麦苗能在暗中诱导NR的原因之一。6-BA可促进麦苗NR诱导。单独6-BA对NR无明显诱导作用,但它可明显促进NO_3~-对酶的诱导。NO_3~-、NO_3~-和6-BA的诱导作用均受环己酰亚胺抑制。6-BA缩短了NR诱导的滞后期,6-BA对NR诱导的促进紧密平行于它对叶绿素积累的促进。而光合作用影响NR的诱导,6-BA缩短NR诱导滞后期可能与6-BA加快叶绿体的发育,促进光合作用之间存在着紧密的联系。     

硝酸还原酶的研究动态

NR的研究已有30多年的历史。近年来,(1)在NR纯化的基础上对其结构和特性已积累了大量资料;(2)根据用新的生物学技术的研究结果,提出酶的诱导可能是酶的从头合成或者酶前体的活化;(3)从NR的合成与降解、活化与钝化等方面,对体内NR活力的调节作了进一步阐述;(4)利用植物NR突变体,开展了NR基因的结构和表达的研究,并取得—定进展。     

亚精胺和低pH对小麦叶片硝酸还原酶活力的影响

多胺是植物体内的一种生理活性物质,具有多种生理功能,近年来受到人们的重视。已有报道多胺参入植物对逆境的适应以及对光和激素的反应。最近,Young和Galston(1983)指出低pH促进植物体内二胺(putrescine)的形成。在我们的工作中也曾见到低pH对水稻黄化叶片硝酸还原酶的暗诱导有明显促进。本文以小麦叶片为材料,研究了多胺——亚精胺(spermi-dine缩写Spd)和低pH对硝酸还原酶(NR)活力的影响。     

春化对油菜叶片硝酸还原酶活性的影响

油莱种子经春化后,其子叶NR活性提高了1.5～4.9倍,真叶展开、雌雄分化及开花期的NR活性也高于对照。去顶芽、高温中断及抑制剂处理证实春化是导致NR活性变化的原因。春化期间幼苗根部对NO_3~-吸收及叶片ATP含量的增加可能是NR活性升高的部分生理机制。     

大豆叶片蔗糖酶的分离纯化及其特性

大豆叶片提取液中存在很高的蔗糖酶活力,皆在30 mg还原糖·克鲜重~(-1)·小时~(-1)以上。经DEAE-纤维素柱层析分离出了三种蔗糖酶。然后分别经Sephadex G—200凝胶过滤,或再经CMC柱层析,最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明,三种蔗糖酶都得到了较好的纯化。它们的反应有相近的最适pH范围,蔗糖酶Ⅰ最适pH在5左右,酶Ⅱ和Ⅲ的最适pH在4～5之间。三种蔗糖酶的Km值(蔗糖)基本相同,约为1.3×10~(-2)M。它们的Vmax相差较大,酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可分别达100.57和13 mg还原糖·mg蛋白~(-1)·小时~(-1)。三种蔗糖酶的分子量非常接近,在71,000～76,000之间。     

棕尾别麻蝇金属硫蛋白的分离纯化及性质分析

将棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina幼虫置于含800 μg/g CdCl₂的食物中取食48 h后,可诱导金属硫蛋白(MT)的合成。诱导处理后的幼虫匀浆上清液经Sephadex G-50分子筛柱、UNO^TM Q1阴离子交换柱和Bio-Gel P-6脱盐柱层析,纯化得到2个亚型,即MT-Ⅰ和MT-Ⅱ。MT-Ⅰ和MT-Ⅱ的分子量均为9 kD,每蛋白分子均含7个Cd和20个巯基,且具254 nm的Cd-SH特征吸收肩。两者的氨基酸组成中,以半胱氨酸含量最高,分别为36.6%和31.8%;而芳香族氨基酸和组氨酸含量甚少,约1%～2%。     

氧化还原对硝酸还原酶的调节作用

氧化还原作用可调节硝酸还原酶(NR)的活力,还原作用使活化形式的酶变为钝化形式的酶,而氧化作用使钝化形式的酶重新活化,这两种形式的酶在代谢上是相互转变的。已经知道,NR复合体由两部分活力组成的,第一部分是黄递酶部分,以NADH或 NADPH作电子供体,可以用细胞色素C作为电子受体;第二部分是硝酸还原部分,可以外源还原的黄素核苷酸或紫精作为电子供体使NO_3~-还原。氧化还原的调节部位是在     

苹果多酚氧化酶的纯化与表征（英文）

运用丙酮浸漬干燥、磷酸盐缓冲液提取、低温离心、硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex（A-50）、Sephadex（G-75）和DEAE-celluse（DE-52）层析等方法从苹果中分离获得一种新的含铜酶蛋白,该酶被命名为多酚氧化酶Ⅱ（polyphenoloxidaseⅡ,PPOⅡ）,纯化倍数是215,纯化收率是23%。PAGE、SDS-PAGE和MALDI-TOF等技术用于测定所获的酶的纯度和分子量。在PAGE和SDS-PAGE均显示一条带,表明PPOⅡ只由一个亚基组成,且已达到单一组分（MALDI-TOF的结果更证实了这一点）。SDS-PAGE和MALDI-TOF的结果都表明PPO的分子量为38204Da。pH值对酶活性和稳定性研究的结果显示,从pH值4.0～7.0随着pH值的增加,酶活性也不断增加;从pH值7.0～11.0,酶活性不断降低。PPOⅡ的最适pH值为6.6最适温度为30℃。     

羊胎盘免疫调节活性因子(SPIF-Ⅰ)的分离纯化和鉴定研究

为探讨研究羊胎盘的活性组分,将羊胎盘绞碎通过匀浆、冻融、超虑等步骤制备羊胎盘提取液,经Sephadex G-50和Sephadex G-25凝胶过滤、Sephadex G-10凝胶柱脱盐,反相高效液相色谱纯化出单一组分并进行理化性质、生物活性初步研究.结果得到紫外特征吸收峰为273nm、分子质量为303.8的羊胎盘免疫调节活性因子-Ⅰ(Sheep placental immunoreglating activity factor-Ⅰ,SPIF-Ⅰ).体外生物学活性试验证明,SPIF-Ⅰ能显著影响小鼠脾淋巴细胞增殖分裂,具有明显的剂量-效应依赖关系.SPIF-Ⅰ是羊胎盘提取液中一种具有免疫调节的小分子活性多肽.