茶芽叶中β—葡萄糖苷酶活性的日变化

一天之中茶芽叶中的β－葡萄糖苷酶活性表现出两个高峰,即在中午１２：００左右达到最高峰,然后下降;下午４：００左右酶活性再次上升,１８：００－２０：００酶活性达到一天次高峰;随后便缓慢下降,次日凌晨０：００－２：００酶活性最低,尔后缓慢上升。酶活性日变化与温度、光照强度及空气相对湿度等生态因子日变化无明显关系。     

茶树硝酸还原酶基因克隆及表达分析

利用茶树全器官转录组文库中硝酸还原酶(NR)的EST,通过RACE技术扩增出NR基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了NR基因在不同茶树品种中的表达。结果表明:NR基因cDNA全长2 927bp,开放阅读框2 652bp,编码一个有884个氨基酸蛋白质,GenBank登录号为JX987133。经BlastX比对,与GenBank中登录的烟草NR相似性达到74%。茶树NR蛋白属于亲水性蛋白,可能为胞质蛋白。25个茶树品种叶片中NR表达水平差异明显,最高值是最低值的22.75倍。因NR是植物氮代谢过程中的关键限速酶,推测25个茶树品种间氮吸收利用能力存在差异。     

茶树冷诱导基因的AFLP筛选及其表达分析

以中小叶茶树良种舒茶早和云南大叶种73-11为材料,于4℃低温处理4 d后,采用AFLP技术筛选出冷诱导下茶树差异表达基因并进行分析.结果显示,实验共获得41个差异片段(TDFs),其中舒茶早产生19条差异条带,73-11产生38条差异条带,两品种共有条带16条.所获得的差异片段按功能可划分为4类,即信号传导蛋白、转录因子、基础代谢相关蛋白、抗逆蛋白质,此外还有一些假设蛋白质以及未知蛋白.利用qRT-PCR对Kh1、Kh3和Kh11差异片段进行验证,结果显示这3个片段均被低温诱导,表达量上升.研究表明,茶树在低温胁迫下的逆境反应非常复杂,涉及多种代谢过程中的众多基因,而且大叶种比中小叶种对低温反应更为敏感.     

茶树叶片类脱水素蛋白的Western-blot分析

为了解茶树脱水素种类与功能,采用Western-blot技术,研究了不同季节及越冬过程中茶树叶片脱水素蛋白家族的表达模式。结果显示:(1)茶树叶片总蛋白提取采用酚-甲醇/醋酸铵沉淀法,用时短、蛋白浓度高、SDSPAGE电泳条带清晰,背景干净,满足茶树Western-blot技术要求。(2)在不同季节及越冬期中发现14~95kD共9种不同分子量的茶树类脱水素蛋白,其中95、65、48、37、34和14kD等6种蛋白表达量较为稳定,季节与越冬期变化不明显;58kD脱水素仅在冬季表达,越冬期不断上升,2月份增加到最高,表达丰度高;28kD脱水素蛋白在冬季表达量高,越冬期与茶树抗寒力变化规律一致;21kD脱水素在夏季和越冬期后期有较高的表达。研究表明,这3种脱水素可能在茶树抗逆中起着重要作用。     

茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白（NRT）是植物吸收和利用硝态氮的一种关键蛋白。运用RACE技术从茶树中扩增出NRT基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了CsNRT基因在不同茶树器官与品种之间的差异表达。结果表明：CsNRT基因的cDNA全长2 061 bp,开放阅读框为1 818 bp,编码含由605个氨基酸组成的蛋白质,GenBank登录号为KJ160503,属于NRT2基因家族。CsNRT为组成型基因,对不同处理的水培茶苗进行定量表达分析显示,该基因在根、茎、叶中都有表达,其中在根部的表达水平最高,1.0 mmol·L-1的NO3-可诱导其表达量上升7.53倍。不同茶树品种中CsNRT基因的表达也有较大差异,‘龙井长叶’和‘凫早2号’的表达量较高,前者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1 NO3-的诱导,后者的响应浓度为1.0和2.0mmol·L-1,而‘舒茶早’在各浓度下的表达差异不明显。     

自然越冬过程中3个茶树品种的生理特性变化及抗寒性评价

以茶树也Camelliasinensis（Linn.）Kuntze页品种‘舒茶早’（‘Shuchazao’）、‘乌牛早’（‘Wuniuzao’）和‘平阳特早’（‘Pingyangtezao’）为实验材料,分析了自然越冬过程中（2011年10月至2012年3月）茶树叶片主要渗透调节物质（可溶性糖、可溶性蛋白质、热稳定蛋白质和脯氨酸）含量、抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性、PSⅡ原初光能转化效率（Fv/Fm）和总叶绿素含量的变化,并应用主成分分析结合隶属函数法对3个茶树品种抗寒性进行综合评价。结果表明：自然越冬期3个茶树品种叶片生理指标随时间推移呈规律性变化,越冬期（12月和1月）与越冬前期（10月）、越冬后期（2月和3月）各指标总体上差异显著,且品种间各指标也有一定差异。可溶性糖、可溶性蛋白质、热稳定蛋白质和脯氨酸含量以及SOD活性均呈先升后降的变化趋势,且峰值多出现在12月或2月;CAT和POD活性、Fv/Fm值和总叶绿素含量则呈先降后升的变化趋势,且均在1月降至最低。主成分分析结果显示：第1主成分（X1）包括可溶性糖含量、SOD活性、CAT活性、POD活性、Fv/Fm和总叶绿素含量,贡献率达到57.97%;第2主成分（X2）包括可溶性蛋白质含量、热稳定蛋白质含量和脯氨酸含量,贡献率达到26.89%。综合评价结果显示：自然越冬期3个茶树品种抗寒性的综合评价值均随时间推移呈先升后降的变化趋势,且均在12月达到最高,据此判断3个茶树品种中‘舒茶早’的抗寒性最强、‘乌牛早’的抗寒性最弱,‘平阳特早’的抗寒性介于二者之间。研究结果显示：在自然越冬过程中供试3个茶树品种的抗寒性与其生理指标变化及生长表现一致,表明综合评价法可用于茶树抗寒性评价。     

茶树冷诱导基因RAV的克隆与表达特性分析

对利用cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF,通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树RAV基因cDNA克隆,其开放阅读框编码361个氨基酸,包含两个保守的结构域AP2和B3,与多种植物RAV蛋白具有高度同源性。qRT-PCR分析表明,茶树RAV基因受低温、乙烯、NaCl等上调表达,最大表达量分别是诱导前的5.8、10.0和1.9倍。在成熟叶片、芽、嫩茎中RAV基因表达量相近,花蕾和嫩根中表达较低,而在种子中不表达。推测该基因在组织中的表达受到严格控制以及在响应非生物胁迫中发挥重要作用。     

两种茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA在原核中表达的研究

采用原核表达系统pET-32a( )载体和BL21trxB(DE3)菌株对两条茶树β-葡萄糖苷酶基因cDNA(GluⅠ和GluⅡ)进行了表达,研究了不同诱导时间、不同诱导温度对两个茶树β-葡萄糖苷酶表达量的影响并测定了两者的活性。表达分析结果表明,诱导6h、25℃时,GluⅠ在总蛋白中所占比例最高;诱导6h、37℃时,GluⅡ在总蛋白中所占比例最高,活性测定结果表明,两种表达蛋白均具有正常的β-葡萄糖苷酶活性,在相同的测定条件下,GluⅡ活性(0.310±0.03U·ml-1)比GluⅠ(0.234±0.03U·ml-1)活性更高。     

用cDNA-AFLP及其改进的方法分析茶树花发育过程中的基因表达

利用cDNA-AFLP及其改进的cDNA-AFLP方法,分析茶树花发育过程中的基因表达。其发育过程中的基因表达可以分为3类:未成熟阶段发育特异基因;成熟阶段发育特异基因;茶树花发育过程中均表达的基因。利用改进的cDNA-AFLP方法,我们获得编码花药发育特异基因:pollen coat protein(Pcp)。用cDNA-AFLP方法,我们获得7个已知功能基因分别编码Cytchrome(P450),beta-primeverosidase,Dnaj-like protein,anthranilate phosphoribosyl transferase(AnPRT),Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenasesmall subunit(RubpS),alpha-tubulin和Carbonic anhydrase。用RACE方法获得pollen coat protein(Pcp),DnaJ-like protein和Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit等3个基因的全长,并已提交GenBank。