Secretory expression of α single-chain insulin precursor in yeast and its conversion into human insulin

A synthetic single-chain porcine insulin precursor (PIP) gene and an α-mating factor leader sequence (αMFL) gene obtained by the PCR method are inserted between the promoter and 3'-terminating sequence of the alcohol dehydrogenase gene ADH1 in plasmid pVT102-U to form plasmid pVT102-U/α MFL-PIP. The single-chain insulin precursor is expressed and secreted to the culture medium by Saccharomyces cererisiae transformed by pVT102-U/αMFL-PIP. The precursor is purified and converted into human insulin by tryptic transpeptidation. The purified human insulin is fully active and can be crystallized. The overall yield of human insulin is 25 mg per liter of culture medium.     

文昌鱼胰岛素样肽的表达、纯化、鉴定及其多克隆抗体制备

为了深入研究胰岛素和胰岛素样生长因子1（IGF－1）的起源和进化以及结构与功能的关系。表达了胰岛素和IGF－1的祖先分子－－文昌鱼胰岛素样肽（ILP）。重组单链ILP的基因用化学方法合成（从cDNA推测的ILPB结构域的C端和A结构域的N端用Ala-Ala-Lys三肽连接起来,并钭B28Arg突变为Lys）,克隆到表达载体pVT102-U中,ILP在酿酒酵母中得到有效表达。发酵液经4步分离纯化,得到均一的单链ILP,经质谱测定分子量和氨基酸组成分析证明表达产物正确。通过Lys-C蛋白内切酶处理将重组单链ILP转化成双链形式。虽然双链ILP与人胰岛素受体没有结合活力。但圆二色性光谱显示它与胰岛素的结构非常相似,用表达的单链ILP免疫新西兰大白兔,获得了高滴度的多克隆抗体。     

[A6-Ala,A11-Ala]-人胰岛素突变体的构建及其生物活性

利用 PCR技术 ,将胰岛素原基因中 A6和 A1 1的 Cys序列突变成 Ala序列 ,以去除 A链的链内二硫键 .突变基因连接到质粒 p BV2 2 0 ,构建了表达质粒 p JG40 3,并且在大肠肝菌中得到表达 .经过 Sephadex G- 50层析可得到纯化的突变人胰岛素原 ( Mut- HPI- Ala) .纯化产物用胰蛋白酶和羧肽酶处理 ,并经 Resource Q阴离子交换柱层析可进一步获得纯化的突变人胰岛素 ( Mut- HI- Ala) .Native- PAGE分析表明 Mut- HI- Ala的结构松散 .Mut- HPI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素原 ( Met- HPI)的 4.6%和 2 .4% .Mut- HI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素 ( Met- HI)的 4.3%和 4.6% .实验结果表明 ,胰岛素 A链内的二硫键对胰岛素的生物活性起着重要的作用     

人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究

目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显著提高并受葡萄糖生理性调控。     

人前胰岛素原基因裸质粒DNA肌肉注射可显著降低链脲佐菌素诱发糖尿病小鼠的血糖水平

通过基因治疗的方法补充胰岛素已用于实验性治疗胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。本研究构建了含有重组人前胰岛素原基因的棵质粒DNA载体(pCMV—IN),将其肌肉注射入链脲佐菌素(STZ)诱发的糖尿病C57小鼠体内,并辅以电穿孔方法,以获得在体胰岛素转基因治疗。该质粒载体表达的胰岛素mRNA,可通过RT—PCR方法在转基因局部的骨骼肌组织中检测到。在接受pCMV—IN注射的糖尿病小鼠中,血浆胰岛素水平显著升高,达到了未注射STZ的正常对照小鼠的水平,且胰岛素的表达可持续至少35d。pCMV—IN质粒注射转基因治疗显著降低了糖尿病小鼠在第7至35d的血糖水平,其下降幅度约6mmol／L;转基因治疗也显著降低了严重糖尿病小鼠的死亡率,其第6周时的死亡率由100％降为37％。结果表明,直接肌肉注射含人前胰岛素原基因裸质粒可获得胰岛素的有效表达,显著降低糖尿病小鼠的血糖水平并降低严重糖尿病小鼠的死亡率。裸质粒注射胰岛素转基因治疗有望成为IDDM的一种有效治疗手段。     

猪胰岛素前体在酵母Kluyveromyces lactis中的分泌表达及其转化为人胰岛素

通过将包括猪胰岛素前体（ＰＩＰ）基因在内的表达框架克隆至质粒ｐＫＤ１衍生的两种载体上而在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ中分泌表达猪胰岛素前体。根据放射免疫测定结果,猪胰岛素前体的表达水平为２０～３０ｍｇ／Ｌ。猪胰岛素前体经过转肽被转变为基因工程人胰岛素。分析结果表明,来自Ｋ．ｌａｃｔｉｓ的人胰岛素,其氨基酸组成、晶体形状和生物活力与天然胰岛素相同。     

利用小鼠骨骼肌细胞持续表达单链胰岛素类似物进行1型糖尿病模型鼠的长效基因治疗

目的探讨Pluronic L64-电脉冲(L/E)体系介导的单链胰岛素类似物基因在骨骼肌组织的传递表达对1型糖尿病小鼠的治疗效果和影响。方法将胰岛素基因中的C肽区域换成(GGGGS)_3,克隆到pcDNA3.1(+)质粒中,构建载体pcDNA-INS。使用链脲佐菌素腹腔注射雄性BALB/c小鼠建立1型糖尿病小鼠模型,并分为L/E联合pcDNA3.1(+)空质粒治疗的L/E-pcDNA3.1(+)组、仅使用pcDNA-INS裸质粒治疗的pcDNA-INS组和L/E联合pcDNA-INS裸质粒治疗的L/E-pcDNA-INS组。模型小鼠在胫骨前肌注射相关质粒进行治疗,且根据治疗方案在注射1 h后进行Pluronic L64-电脉冲处理,并以生理盐水处理的正常小鼠(NC)组作为对照。记录各组小鼠的血糖、体质量、血清胰岛素含量、生存率、免疫组化、外形特征及组织病理等指标。结果 (1)pcDNA-INS质粒通过酶切和测序鉴定无误;(2)与NC组相比,模型小鼠血糖显著上升,体质量显著下降(P0.05),且胰岛遭到严重破坏;(3)L/E-pcDNA-INS组的血糖水平和血清胰岛素含量显著缓解,与NC组较为接近,pcDNA-INS组的血糖缓解和胰岛素补偿远不及L/E-pcDNA-INS组(P0.05),且与NC组之间的差异一直有统计学意义(P0.05)。第4周免疫组化结果显示,L/E-pcDNA-INS组的胰腺胰岛素表达较少,但肌肉胰岛素表达量较高,且该组生存率较高,与NC组均为100%(12/12),L/E-pcDNA-INS组的病理结果和外形特征与NC组小鼠最为接近,L/E-pcDNA3.1(+)组与pcDNA-INS组在不同部位均有不同程度的病变发生,且鼠毛疏少粗糙,体形较小。结论 Pluronic L64-电脉冲体系与单链胰岛素类似物基因联合治疗1型糖尿病的效果较好,且无明显不良影响,可为相关研究提供实验依据。     

猪胰岛素前体在酵母Kluyveromyces lactis中的分泌…

通过对包括猪胰岛素前体（ＰＩＰ）基因在内的表达框架克隆至质粒ｐＫＤ１衍生的两种载体上而在酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ中分泌表达猪胰岛素前体。根据放射免疫测定结果,猪胰岛素前体的表达水平为２０－３０ｍｇ／Ｌ,猪胰素胶体经过胰肽被转变基因工程人胰岛素,分析结果表明,来自Ｋ．ｌａｃｔｉｓ的人胰岛素,其氨基酸组成、晶体形状和生物活力天然胰岛素相同。     

西方许旺酵母α-淀粉酶的基因克隆及其在啤酒酵母中的高效表达与分泌

以E .coli/yeast穿梭质粒YCEp1为载体构建许旺酵母部分基因组文库 ,在大肠杆菌中扩增后提取混合质粒DNA ,经电转化非缺陷标志啤酒酵母AS .2 1 36 4 ,在YPDS平板 ( 1 %葡萄糖和 1 %可溶性淀粉 )上用淀粉水解活力筛选含水解淀粉能力的阳性转化子 .从阳性转化子中分离融合质粒证实含 5 0kb的插入片段 .用α 淀粉酶基因两端序列设计的引物PCR扩增及扩增片段序列分析证实该片段中含有α 淀粉酶全部编码序列 .该片段能在啤酒酵母中表达α 淀粉酶 ,说明该片段带有α 淀粉酶基因 5′ 上游序列和 3′ 下游序列 .该转化子在YPDS平板 30℃培养 48h形成清晰可见的水解淀粉圈 .发酵液 (YPDS) 48℃可获得 740～ 780mU/mL产酶活力和高的生物量 .PAGE证实发酵液有α 淀粉酶蛋白带 ,占胞外总蛋白含量的 1 2 %以上 .说明在载体YCEp1上许旺酵母α 淀粉酶基因自身启动子 ( promoter)和终止子(terminator)在啤酒酵母AS .2 .1 36 4中同样被识别且高效表达 .有工业应用前景的水解淀粉酵母菌株构建成功 .     

类胰岛素生长因子-1的C结构域不影响胰岛素二硫键的热力学稳定性

胰岛素和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)都属于胰岛素超家族,两者不但一级、三级结构有较高的同源性,而且生理功能也有少量交叉.然而两者的折叠行为却有很大的差别：胰岛素及其重组前体(PIP)只折叠成一种热力学稳定的二硫键配对,而IGF-1却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体.为了了解两者折叠行为差异的分子机制,制备了由胰岛素的A,B链和IGF-1的C结构域构成的单链杂交分子——[B10Glu]Ins/IGF-1(C),研究了该杂交分子二硫键的热力学稳定性以及它在含有少量巯基试剂的变性剂中的解折叠程度,同时还纯化了该杂交分子一种主要的非天然二硫键异构体,并研究了它的再折叠情况. 观察到IGF-1中C结构域的引入并未改变胰岛素分子的折叠热力学,但是影响了折叠的动力学过程.     

基因工程人胰岛素原和胰岛素的分离纯化及性质研究

携带pWR 590-BCA4质粒的大肠杆菌经发酵培养,提取出人胰岛素原融合蛋白。该融合蛋白经BrCN降解,氧化磺化及QAE-Sepha-dex A-25和Sephadex G-50分离所得到的磺化胰岛素原,经折叠和分离得到了人胰岛素原(HPI)。HPI 再经酶切转化为人胰岛索(HI)和C-肽,HI 的得率为5 m8/L,并获得了HI 的晶体。HPI 和HI 的氨基酸组成、N-端顺序和C-末端分析均与预期值相符。HI 的RIA 活性为猪胰岛素的99%,整体活性为26～27U/mg。     

重组单链胰岛素的连接肽与其生物功能的关系

为研究重组单链胰岛素的生物活性与连接肽之间的关系,用基因定点突变的方法分别以二肽A-K,七肽A-A-A-A-A-A-K和十二肽A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-K连接胰岛素的B30和A1,得到3个单链胰岛素分子PIP,[A]₅PIP和[A]₁₀PIP.它们的受体结合能力分别为胰岛素的0.14%, 14.3% 和11.1%, 体内生物活性与受体结合能力一致,而它们的促生长活性分别为胰岛素的17%,116.3%和38%.结果表明:(ⅰ)单链胰岛素也具有胰岛素的促代谢和促生长功能;(ⅱ)单链胰岛素与胰岛素受体的结合能力与连接肽的长度和氨基酸组成密切相关, 其受体结合能力随连接肽的改变,可由无到100%,进一步说明胰岛素与其受体结合时,B链C端远离A链N端是必需的;(ⅲ)单链胰岛素的促细胞生长能力也与连接肽长度和组成密切相关,且比其自身的促代谢能力强.     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

人胰岛素A、B链基因的合成、克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据人胰岛素A、B链的多肽顺序,设计并用一种简便快速的多肽基因合成了A、B链基因。合成的A 链和B 链基因分别克隆到pWR590质粒上,构建了表达型质粒pWR590-HIA和pWR 590-HIB,它们能够表达由β-半乳糖苷酶N-端约590个氨基酸残基与A 链或B 链组成的融合蛋白(两者之间由Met 连接)。A 链或B 链融合蛋白经BrCN 降解,磺化及分离纯化等步骤,得到了磺化A、B 链。磺化A、B链体外重组得到人胰岛素。     

重组圆锥芋螺胰岛素G1的原核表达与降糖活性检测

为缩短重组胰岛素起效时间,达到快速降低餐后血糖的作用,以圆锥芋螺胰岛素G1 (cI G1)为研究对象,参照人胰岛素原(hPI)和圆锥芋螺胰岛素G1原(cPI G1)基因设计重组cPI G1的核苷酸序列,按照大肠杆菌Escherichia coli密码子使用频率进行密码子优化后构建pET22b(+)-cPI G1质粒,以E. coli BL21(DE3)菌株为宿主进行原核表达,获得重组cPI G1蛋白,经胰蛋白酶切割及纯化得到重组cI G1,其效价为25.9 IU/mg。空腹血糖测试(FBGT)和葡萄糖耐量实验(OGTT)表明,cI G1可迅速降低正常和链脲佐菌素(STZ)致糖尿病模型小鼠的血糖,但持续时间短,研究结果为重组速效胰岛素的开发提供参考。     

一种人胰岛素类似物的制备、鉴定与活性研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B25和B26位之间插入Glu,构建了［B10 Glu,B25-Glu-B26］胰岛素原融合蛋白基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性、凝胶过滤等步骤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经过DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得到胰岛素突变体类似物,并经过质谱测定鉴定.凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,圆二色谱（CD）测定了构象的变化.并分别测定了放免活性、受体结合活性及小白鼠低血糖惊厥实验.结果表明,突变体分子缔合性明显下降.放免活性和受体结合活性分别约为标准胰岛素的63.5%和114.4%, 整体活力略高于天然胰岛素.     

hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究

旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平.在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段.与表达载体PET-30a连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,收集洗脱峰.对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性.结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%.经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素.Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性.获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料.     

人胰岛素突变体GIRR的分离纯化及性质研究

构建人胰岛素原突变体GIRR(A2 1Asn→Gly,B1 7Leu→Ile ,B31Arg ,B32Arg)基因的原核融合表达载体并进行表达和纯化 ,进一步对其性质进行研究。将人胰岛素原突变体基因重组到pTXB1融合表达载体上 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中得到高效表达。表达产物经几丁质亲和柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶B的酶促转化等步骤 ,得到纯的人胰岛素突变体GIRR ,其纯度经HPLC鉴定达到 95 % ,氨基酸组成和设计相符 ,其受体结合活性是猪胰岛素的 1 0 5 % ,生物活性为 2 6.8IU/mg。其血浆半衰期为 2 0分钟 ,比标准猪胰岛素提高 3倍多。结果提示本突变体具有更长的半衰期 ,为长效胰岛素的制备提供了新的思路。     

一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略

[目的] 为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,[方法] 将构建的表达载体pPICZα-IP 电转至毕赤酵母X-33中,在100 μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达人源胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6.在此基础上,以过量表达胰岛素前体的B4和S6为出发菌株,以SacI线性化的表达载体pPICZα-IP进行重复电转化,并在1000 μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4.[结果] 该菌株在5L规模发酵罐上,人源胰岛素前体产量是低拷贝数菌株B7的2.7倍,且菌体并未因拷贝数高而表现出生长不良的现象.实时定量PCR检测后,发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍.[结论] 综上结果表明,采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略,能有效促进目的基因的转录水平,最终显著提高目标蛋白的产量.     

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CCRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S－78进行表达．培养物的上清用酶标(ELlSA)鉴定为阳性,而对照S－78、pVT102u／α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mg／L。表达产物经阳离子交按层析(CM—Sphadex C₂₅)和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N－端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。