利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。本文利用CRISPR/Cas9平台,在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在糖尿病细胞治疗中的应用研究进展

近几年来,基因编辑技术快速发展,为在特定位置精确操控基因组提供了一个有效而精确的工具。CRISPR/Cas9系统是一种新型的基因编辑工具,可实现对人类基因组的高精度修饰,是疾病建模和治疗的可行选择。随着CRISPR/Cas9系统技术的广泛应用,在糖尿病领域有不少相关研究出现。该文从干细胞分化为β细胞、基因编辑重编程为β细胞以及修饰基因三个方面总结了CRISPR/Cas9技术在糖尿病治疗中的应用。     

CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种RNA引导的基因组靶向编辑技术,能对基因组序列进行精确编辑,在探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因、改良品质性状等方面具有广阔的应用前景。近年来,随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入和改造,该系统以其操作简易、省时、高效等优点在生物学研究的众多领域中得以推广和应用,特别是在果蝇(Bombyx mori)、家蚕(silkworm)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和蝴蝶(butterfly)等多种昆虫中。本文概述了CRISPR/Cas9的结构、作用原理及发展优化,总结了CRISPR/Cas9导入昆虫的策略和在昆虫中的应用,以及对CRISPR/Cas9系统产生脱靶问题的应对策略,以期对经济昆虫和有益昆虫的分子育种、害虫的生物技术防控等研究提供参考。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

一种拟南芥基因高效编辑体系研究

CRISPR/Cas9基因编辑系统操作简单易行,无需引入外源基因,生物安全性高。但怎样快速筛选获得不含外源转化元件的基因编辑后代是一个关键技术问题。本研究创造性的将拟南芥种皮特异性启动子At2S3与荧光筛选标记基因mCherry组装进植物基因组定点编辑CRISPR载体pHDE中,以拟南芥as1为靶基因,构建一种通过荧光标记筛选、实现转化后代中Cas9 Free的基因高效编辑体系。结果表明,通过同源重组方法构建的带有筛选标记的CRISPR载体与设计相符,外源插入片段正确。挑选转化后种皮上带有红色荧光标记的阳性种子培育得到T₁代植株,经PCR验证,成功获得as1定点敲除的纯合突变植株,纯合子比率达到40%;挑选T₁代纯合突变上不带荧光的种子,培育得到的T₂代植株中,PCR检测不到Cas9片段,实现了编辑后代的Cas9 Free。本研究构建的一种带有可视化筛选标记的基因高效编辑体系,成功实现编辑后代中无外源插入的Cas9等转化元件,生物安全性高,为基因组定点编辑技术在植物遗传资源改良中的高效利用提供了借鉴与参考。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望

CRISPR系统具有精确识别及剪切特异性DNA序列功能而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势,成为新一代最具代表性的基因编辑技术。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HDR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。该文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR/Cas系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组或非同源末端连接修复途径介导的基因定向编辑技术及应用。     

CRISPR/Cas9系统中引导RNA的研究进展

CRISPR/Cas9系统作为重要的一种基因编辑工具,自产生以来广泛应用于各种生物体基因组序列的精确编辑,可在特定位点产生核苷酸的删除、插入或替换,从而改变编码基因的功能。以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术将应用于包括生物育种在内的各项生物技术领域,产生新一代生物技术产品。目前关于CRISPR/Cas9的研究报道多集中于Cas9蛋白的结构功能,以及CRISPR/Cas9系统的工作原理。引导RNA(Guide RNA)作为CRISPR/Cas9系统的重要组分之一,也是基因编辑技术领域的研究热点,近来有多篇文章报道通过改良引导RNA从而提高CRISPR/Cas9的编辑效率和精确性。对CRISPR/Cas9系统中的引导RNA研究进展进行了综述,围绕引导RNA的序列组成、结构特征以及转录产生方式这3方面内容,有助于全面了解CRISPR/Cas9系统的结构特征,讨论了引导RNA对CRISPR/Cas9基因编辑效率的影响,有利于CRISPR/Cas9系统的使用。最后,展望引导RNA今后的研究发展趋势,旨在解决CRISPR/Cas9目前存在的相关问题,优化出效率更高、精度更高的基因编辑技术。     

基于CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选功能基因及调控元件研究进展

CRISPR/Cas9系统是一种近年来被广泛应用于基因组编辑的强大工具。通过将CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白突变后,使其失去剪切活性而成为dCas9 (nuclease-dead Cas9),再结合基因功能丧失(loss-of-function,LOF)、基因功能激活(gain-of-function, GOF)以及非编码功能基因鉴定技术即可实现全基因组高通量的功能基因及调控元件靶向鉴定和筛选。目前,该技术已被广泛应用于疾病免疫机理、药物靶点筛选和动物遗传育种等研究,为生命医学和基础科学带来了全新高效的技术方法和研究思路。本文综述了基于CRISPR/Cas9技术在全基因组中高通量筛选功能基因及调控元件的方法及研究进展,重点阐述了CRISPR/Cas9系统在动物细胞中筛选功能性基因的方法,以期为基因编辑及相关研究领域提供参考。     

CRISPR/Cas核糖核蛋白介导的植物基因组编辑

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)系统作为一种重要的基因编辑工具,自诞生以来被广泛应用于作物的性状改良。与CRISPR/Cas DNA载体介导的植物基因组编辑相比,CRISPR/Cas核糖核蛋白(CRISPR/Cas ribonucleoprotein, CRISPR/Cas RNP)介导的植物基因组编辑具有作用迅速、脱靶率低和无外源DNA插入(DNA-free)等优点,因而无需清除CRISPR编辑工具而更容易获得纯合的编辑体。但是,由于植物细胞转化方法和细胞再生技术的限制,不借助筛选标记的辅助将CRISPR/CasRNP直接导入植物细胞并获得高效基因编辑仍比较困难,直接限制了CRISPR/CasRNP在植物基因组编辑中的广泛应用。本文系统介绍了CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术的分子作用机理及其优势,并总结了CRISPR/Cas RNP导入植物细胞的方法,最后对CRISPR/Cas RNP在植物基因组编辑中的新应用和新思路进行了展望,以期为进一步改进CRISPR/Cas RNP基因组编辑技术和扩大其在作物改良中的应用提供参考。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

基于CRISPR/Cas9技术的基因敲入/敲除策略

成簇的规律间隔性短回文序列(CRISPR)基因编辑系统,因其设计简单操作方便和无种属限制,已成为一种广泛应用的基因组定点编辑工具,在复杂的基因组编辑,例如基因的人源化改造以及条件等位基因的构建中有所应用。在自然界中,CRISPR系统拥有多种类别。其中,CRISPR/Cas9系统是研究最深入、应用最成熟的一种。本文针对CRISPR/Cas9系统,分别从基因敲入/敲除片段的大小、同源臂长短、构型即递送方式等技术环节进行综述,阐述不同设计及操作条件下由CRISPR/Cas9系统介导的基因敲入/敲除的效率差异。     

CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。     

一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

CRISPR/Cas9技术在表观基因组中应用的探讨

成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas9)技术是近5年来在生物基因改造中应用最广泛的新型编辑工具,具有成本低、效率高、多位点打靶以及脱靶效应可预测等优点,正在成为不同生物体中设计基因组的有力工具。表观遗传的不断发展对分子生物学的中心法则提出挑战,包括DNA中碱基和组蛋白的修饰、非编码RNA对基因组和染色质结构的调节中都起到至关重要的作用。对CRISPR/Cas9系统的改造可以对表观基因组进行修饰。对CRISPR/Cas9系统在表观基因组中进行修饰的应用进行概述,讨论了定向修饰基因组存在的问题,以期为CRISPR/Cas9系统在基因组编辑领域的应用提供参考。