CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

CRISPR/Cas9基因编辑技术最新研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是存在于细菌和古细菌的获得性免疫系统,通过其转录产物cr RNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated,Cas),尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵DNA。该系统也由于其种种优势而被广泛应用于基因编辑技术。本文将主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念、原理、最新研究进展等三个方面进行阐述,重点介绍其最新研究进展,并就CRISPR/Cas9技术的未来发展进行简要论述。     

CRISPR/Cas9技术在表观基因组中应用的探讨

成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas9)技术是近5年来在生物基因改造中应用最广泛的新型编辑工具,具有成本低、效率高、多位点打靶以及脱靶效应可预测等优点,正在成为不同生物体中设计基因组的有力工具。表观遗传的不断发展对分子生物学的中心法则提出挑战,包括DNA中碱基和组蛋白的修饰、非编码RNA对基因组和染色质结构的调节中都起到至关重要的作用。对CRISPR/Cas9系统的改造可以对表观基因组进行修饰。对CRISPR/Cas9系统在表观基因组中进行修饰的应用进行概述,讨论了定向修饰基因组存在的问题,以期为CRISPR/Cas9系统在基因组编辑领域的应用提供参考。     

细菌中CRISPR/Cas系统的应用和优化

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统在近年来得到越来越广泛的应用。相比传统的基因组编辑技术,CRISPR/Cas系统具有编辑效率高、特异性强、花费低、对实验技术要求低等优势。其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR/Cas系统分别仅需要单个Cas9蛋白和单个Cpf1蛋白作为切割双链DNA的工具,因此特别受到研究者们的青睐。目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于斑马鱼、小鼠、人类细胞等真核生物的基因组编辑中,并取得一系列重要成果,但在细菌领域进行的相关研究并不多。文中将简单描述CRISPR/Cas系统及其作用机制,重点介绍该系统的优化以及近年来其在细菌学领域所取得的进展。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)协同其相关蛋白Cas组成了细菌和古细菌的获得性免疫系统。利用该系统可以对外来某一特定单链或双链DNA实施高度特异性沉默或降解的特性,近年来对基因组进行精确定点编辑的CRISPR/Cas系统迅速发展。着重介绍了CRISPR/Cas系统的研究历史、结构、分类及作用机制,并分析讨论了现阶段以Cas9为核心的Ⅱ型系统在应用方面存在的问题及前景。     

基于CRISPR/Cas9的精准基因编辑技术研究进展

基因编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。基于CRISPR/Cas9系统的精准编辑技术是一个操作方便、应用广泛的基因编辑技术,与传统的CRISPR/Cas9不同,精准基因编辑技术可以在不需要DNA模板的情况下对基因进行定点突变。本文重点介绍了近年来基于CRISPR/Cas9介导的精准基因编辑技术的发展,并深入分析了基因精准编辑技术面临的挑战和机遇。     

运用改良的CRISPR/Cas9系统建立HtrA2敲除细胞株

能识别特定基因组DNA序列的核酸酶是基因编辑的重要工具。在单链RNA引导下,来源于一种产脓链球菌的成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)关联蛋白(CRISPR-associated protein 9,Cas9)能够发挥其核酸酶功能对基因组特定序列进行剪切。这种功能依赖于单链引导RNA(single-guide RNAs,sg RNAs或g RNAs)中20 nt的核心靶向序列。在该研究中,作者对已有的CRISPR/Cas9系统载体进行了优化,简化了g RNA表达载体的构建。运用优化后的CRISPR/Cas9系统,我们敲除了HEK293T细胞中HtrA2基因的第一个外显子。这一改进大幅度降低了CRISPR/Cas9技术的使用成本。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

CRISPR/Cas9:基因编辑的新时代

基因编辑技术是通过核酸内切酶对基因组DNA进行定向改造的技术,可以实现对特定DNA碱基的缺失、替换等,常用的四种基因编辑工具分别是:巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及CRISPR/Cas9系统。其中CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术具有组成简单、特异性好、切割效率高的优点。该文对CRISPR/Cas9系统的结构组成和功能机制,动植物基因靶向编辑和人类在遗传性疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤方面进行综述,旨在对CRISPR/Cas9系统的现状和发展进行总结和展望。     

CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用

源于细菌和古菌的Ⅱ型成簇规律间隔短回文重复系统[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated nuclease 9 (Cas9),CRISPR/Cas9]近年被改造成为基因组定点编辑的新技术。由于它具有设计简单、操作方便、费用低廉等巨大优势,给遗传操作领域带来了一场革命性的改变。本文重点介绍了CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段靶向编辑方面的研究和应用,主要包括DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位,这一有效的DNA片段编辑方法为研究基因功能、调控元件、组织发育和疾病发生发展提供了有力手段。本文最后展望了Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的应用前景和其他类型CRISPR系统的应用潜力,为开展利用基因组DNA片段靶向编辑进行基因调控和功能研究提供参考。     

CRISPR/Cas:可应用于病毒检测和抗病毒治疗的前沿技术（英文）

近年来,病毒感染疫情频发,凸显了高效便利的病毒检测技术以及抗病毒药物研制的迫切性。基于成簇的规则间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）的工程系统在靶向和切割核酸方面具有较高的特异性和效率,是目前使用最为广泛的基因编辑工具。该系统目前也广泛应用于病毒学研究和相关医疗实践。本文重点介绍了Cas9、Cas12和Cas13这三种最常用的CRISPR/Cas系统在病毒检测和抗病毒治疗中的应用。在病毒检测方面,Cas9通过与荧光传感器、电化学传感器和侧流层析试纸等生物传感器相结合,提高了生物传感器检测的灵敏度和准确性。Cas12和Cas13则基于其反式切割活性,目前已经开发了多种技术来检测DNA和RNA病毒,如SHERLOCK和DETECTER。在抗病毒治疗方面,Cas9已被用于靶向切割病毒DNA,从而抑制病毒的复制,其靶标包括DNA病毒的基因组和逆转录病毒的中间产物DNA;而Cas13则被用于靶向病毒RNA,其靶标包括RNA病毒的基因组和病毒mRNA。尽管CRISPR/Cas系统在灵敏度、效率和便利度等方面具有多种优势,但在一些方面仍不可避免地存在局限性,如脱靶效应、...     

利用CRISPR/Cas9和piggyBac实现果蝇基因组无缝编辑

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9)是第三代基因组编辑技术。在sgRNA引导下,Cas9核酸内切酶作用于特定基因组序列,产生DNA双链断裂(double-strandedbreaks,DSBs),利用同源定向修复(homology-directedrepair,HDR)可实现对靶基因的特异性基因敲除(knock-out)或敲入(knock-in)。传统的技术方案将CRISPR/Cas9技术与Cre/loxP或FLP/FRT系统联用,可实现高效的基因打靶,也易于移除打靶过程中引入的筛选标记。然而,筛选标记移除过程中会在基因组中残留34个碱基的标签序列。因此,对基因组进行精确编辑的同时不引入无关序列仍有一定难度。在人工诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的基因组编辑中,CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用的两步法策略能够实现这一目标:首先运用CRISPR/Cas9技术,利用同源定向修复原理引入基因突变及筛选标记,然后利用piggyBac转座酶将筛选标记精确移除。借鉴该方法的技术原理,本研究对果蝇(Drosophila melanogaster)CG4894基因进行了无缝编辑(seamless genome editing),成功将该基因第18外显子上第21位的酪氨酸(tyrosine,Y)突变为半胱氨酸(cysteine,C),且测序结果显示基因组中除设计位点之外并无其他外源序列残留。CRISPR/Cas9技术和piggyBac转座酶联用策略为果蝇基因组的精确编辑提供了更多选择。     

CRISPR/Cas9高通量筛选技术与肿瘤治疗

成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR),是细菌或古菌在与噬菌体长期生存进化获得的一种免疫系统. 根据Cas蛋白(CRISPR-associated protein)的不同,CRISPR系统可分为3种. 其中II型CRISPR/Cas9已被改造成为一种有效的基因编辑工具,并运用于多种物种基因的改造. 作为1种基因编辑的手段,CRISPR/Cas9技术通过诱导DNA双链断裂损伤,进一步干扰基因的表达. 与传统的基因编辑技术相比,CRISPR/Cas9技术显示出效率高、成本低和易操作等特点. 与此同时,二代测序技术的发展促进全基因组的解析. CRISPR技术结合高通量二代测序手段的使用,在肿瘤的治疗领域中已发挥出了独特的优势. 本文就近年来CRISPR/Cas9高通量筛选技术的发展,及其在肿瘤治疗过程中的应用进行综述.     

利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统在水稻中快速引入遗传多样性

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-核酸内切酶9(CRISPR/Cas9)系统已经成为许多物种特定基因组编辑的强大工具.利用CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功构建共敲除水稻(Oryza sativa)中8个农艺性状基因的载体.通过遗传转化实验和DNA测序,发现8个基因在T_0代有较高的突变效率,并且T_0代突变株的突变类型包括杂合突变和纯合突变.此外,还在T_0代突变株中发现了纯合的六突突变株、七突突变株、八突突变株.由于T_0代植物中获得丰富的突变体组合类型,因而,观测到靶基因多样的突变表型.该研究表明,CRISPR/Cas9系统在作物育种过程中快速引入遗传多样性方面的潜力.     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas9:一种新型的基因组定点编辑技术

CRISPR/Cas9系统是原核生物抵御病毒或质粒等外来遗传物质入侵的一种获得性免疫系统,主要由非特异性的Cas9核酸酶和起识别作用的cr RNA所组成。相较于传统的基因组编辑技术,基于CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑技术具有快速、简单、高效等优点,并且几乎可以用于任何物种的基因编辑。尽管CRISPR/Cas9系统的基因组特异性还有待进一步确认,但该系统在基因组编辑方面的简便性和有效性必将促进生物学的研究和人类疾病基因治疗方面的发展。