EV71与CA16双价灭活疫苗诱导小鼠免疫原性研究

目的评价EV71和CA16双价灭活疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫和细胞免疫应答。方法分别应用EV71和CA16双价疫苗、EV71和CA16单价疫苗按单针、两针(0,14 d)的程序免疫小鼠,采用细胞病变法检测血清第1针免疫后21 d时中和抗体效价,应用LUMINEX液相芯片技术检测小鼠脾单个核细胞体外经抗原刺激分泌细胞因子的水平。结果双价疫苗与EV71单价疫苗单针、两针免疫相比,EV71中和抗体几何平均值相近(118.8∶84.0;159.5∶156.8,P0.05)。双价疫苗与CA16单价疫苗单针免疫诱导的CA16中和抗体均为阴性;两针免疫CA16中和抗体几何平均值一致(30.0∶26.9,P0.05)。加强免疫7 d后,小鼠脾MNC经EV71抗原刺激,双价疫苗较EV71单价疫苗诱导Th2类细胞因子IL-4、5、6、10和炎症因子TNF-α的分泌水平显著增高(P=0.020,P=0.027,P=0.038,P=0.019,P=0.026);MNC经CA16抗原刺激,双价疫苗与CA16单价疫苗相比诱导细胞因子水平差异无统计学意义(P0.05)。结论双价疫苗可诱导与单价疫苗相似的中和抗体应答水平,并可提高Th2类细胞因子应答,研究为EV71和CA16双价灭活疫苗的研发提供了实验依据。     

怀化市2008—2015年手足口病流行病学特征分析

目的分析怀化市2008—2015年手足口病的流行病学特征,为制定本地区手足口病的防控措施提供科学依据。方法采用描述性流行病学方法,对怀化市2008—2015年报告的手足口病病例进行流行病学特征及病原学检测分析。结果怀化市2008—2015年共报告手足口病病例46 333例,每年发病率分别为51.04/10万、33.40/10万、98.85/10万、84.79/10万、181.96/10万、126.44/10万、269.57/10万、125.95/10万。共报告重症病例601例,重症病例发生率占比1.30%,报告死亡病例8例,病死率占比0.02%。在此期间怀化市所有县市区均有病例报告,年均发病率较高的分别是鹤城区252.86/10万、中方县159.48/10万、洪江区152.27/10万、芷江县130.13/10万。每年4—6月和10—12月为发病高峰期;0~3岁儿童是发病重点人群,该年龄段发病数占总报告病例数85.07%;男女性别比1.8∶1。在2 880份实验室确诊病例中肠道病毒71型阳性1 915例,柯萨奇病毒A16型阳性380例,其他肠道病毒阳性585例,2015年其他肠道病毒阳性占比升至43.43%。结论怀化市手足口病在高发季节应继续采取综合防控措施,控制疫情的流行和暴发。     

EV-A71和CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞诱导差异性IFN-I产生通路相关基因表达的研究

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种全球性的传染病,其主要病原体为肠道病毒A组71型(Enterovirus group A 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(cosackievirus A 16,CV-A16)。EV-A71感染易引发重症病例及死亡病例,而CV-A16感染所致的症状普遍较轻,且CV-A16容易引发重复感染,但目前其中的机理仍不清楚。本研究比较了EV-A71与CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞16HBE后I型干扰素(Type I interferon,IFN-Ι)产生相关基因的改变。结果发现EV-A71感染后TLR3、TLR7、RIG-I、MDA5、MAVS、MyD88、IRF3、IRF7、IFNα和IFNβ的基因表达量均发生了显著性地上调,而在CV-A16感染后仅MDA5显著性上调;TLR3和IRF3的基因表达水平显著性地下降,而其它基因表达水平均无显著性地变化。此外,病毒滴度和病毒拷贝数的检测结果显示,CV-A16在16HBE上的复制效率明显高于EV-A71。上述结果提示我们EV-A71和CV-A16感染16HBE对其IFN-I产生相关基因表达的影响完全不一样,且CV-A16更容易感染人呼吸道上皮细胞。本研究为EV-A71和CV-A16引起的临床症状差异的机理研究以及CV-A16重复感染的机理研究提供了线索。     

人免疫球蛋白中肠道病毒71型中和抗体效价的测定

采用经典微量细胞病变法,应用近两年分离自中国手足口病(HFMD)高发区的3株肠道病毒71型(EV71)病毒株,对中国不同血液制品厂家生产的35批人免疫球蛋白制品进行抗-EV71中和效价检测。结果显示,3株不同EV71病毒株间的抗-EV71中和效价差异均在4倍以内,差异无显著的统计学意义(F=2.323,P0.05)。根据这3株毒株检测结果判定,35批人免疫球蛋白的抗-EV71均为阳性,肌肉注射用免疫球蛋白(简称肌丙)的抗-EV71-GMTs(525.9)显著高于静脉注射用免疫球蛋白(简称静丙)的GMTs(252.3,F=66.518,P0.01)。30批静丙的抗-EV71-GMTs中和效价分布在128.0~384.0之间。应开展原料血浆中抗-EV71中和效价的筛选,研制高效价的EV71特异性免疫球蛋白制品,用于HFMD的治疗和预防。     

实时细胞监测技术的人肠道病毒71型感染性检测方法研究

开展基于微电子传感器技术的实时细胞监测技术(Real-time Cell Assay,RTCA)在人肠道病毒71型(HEV71)病毒诱导的细胞病变检测方法中的应用价值研究。动态观察RD细胞不同阶段的生长指数,选择合适的细胞浓度开展HEV71病毒感染力和血清中HEV71中和抗体效价测定。同时应用传统的微量试验作为方法学的比较和结果验证。细胞阻抗通过软件转换成细胞指数CI值和可视的动态变化曲线显示,在96电子孔板上,当RD细胞浓度为1.5×104个/孔时能满足HEV71病毒感染性检测的观察天数大于5d的要求。与传统显微镜观察细胞CPE的方法比较,两种方法在接种病毒后的132h(约5.5d)产生病毒致细胞病变的终点判断结果一致。在中和抗体试验中,三份感染HEV71病毒的人血清中和抗体效价CI值结果和传统的96孔微量板镜检法结果相符。实时细胞监测技术可以提示研究者,即使是终点判断结果为相同的中和抗体滴度的血清,其所含病毒诱导的细胞病变出现时间也可能有所不同。实时细胞监测技术用于HEV71病毒感染力和血清中和抗体效价检测与传统的微量板法检测相比可以节省劳力,消除人为判断的误差,可以作为传统检测方法的补充手段之一,也可以动态观察细胞病变的发生和发展,为进一步深入研究病毒感染力强弱或血清抗体消长提供更为科学的数据。     

EV-A71感染导致的重症手足口病的机制及防控研究进展

手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种具有高度传染性的病毒性传染病,通常夏秋季高发于幼儿和儿童;若患儿并发呼吸和循环功能障碍、神经系统受累等临床症状称为重症HFMD。少数重症病例可出现肺水肿、脑炎和急性弛缓性麻痹等罕见的神经或循环系统并发症,甚至导致患儿死亡。引起HFMD最常见的病原是肠道病毒A71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A16型(CV-A16),而EV-A71是引起重症HFMD的主要病原体。EV-A71导致的重症HFMD已成为全球重要的公共卫生问题,减少EV-A71流行范围和预防EV-A71重症HFMD非常重要。EV-A71疫苗是目前最有效的预防重症HFMD发生的措施;中国已经批准了三个厂家的灭活EV-A71疫苗上市并已开展适龄儿童接种,以期预防EV-A71感染引起的重症HFMD,但这种疫苗不能预防其它肠道病毒如CV-A16,CV-A6和CV-A10等引起的HFMD。据文献报道,小分子抑制剂芦平曲韦可以通过阻止EV-A71的3C pro蛋白活性来抑制EV-A71复制;小干扰RNA和单克隆抗体也可抑制EV-A71复制。研制EV-A71和CVA16双价灭活疫苗是防控HFMD的策略之一,而小分子抑制剂、小干扰RNA和单克隆抗体的研制和应用等也是临床防治HFMD的探索。     

MMP-9-1562位点T等位基因与儿童EV71重症脑炎易感性关系的研究

目的:研究基因MMP-9-1562位点基因多态性与肠道病毒71型(EV71)脑炎的关系,探讨不同基因型对EV71脑炎患病风险及病情程度的影响.方法:运用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测EV71感染阳性病毒性脑炎患儿及正常对照组儿童基因组MMP-9-1562位点碱基变异情况.结果:EV71脑炎重症组MMP-9-1562位点T等位基因频率分布明显高于EV71脑炎轻症组(16％VS7.5％,OR 2.362,95％CI 1.170-4.768,P＜0.05).MMP-9-1562位点T等位基因携带者感染EV71后可明显增加神经系统并发症的发生率.EV71脑炎患儿MMP-9-1562位点T等位基因频率分布与正常对照儿童比较无明显差异.结论:MMP-9-1562位点T等位基因携带者在感染EV71后易发展为重症中枢神经系统感染;MMP-9-1562位点T等位基因可增加EV71感染后神经系统并发症的发生率;MMP-9-1562位点单核苷酸多态性与EV71脑炎的发病率无关.     

EV71-B5亚型在亚太地区流行病学及进化分析

EV71-B5亚型自2003年首次报道以来,在亚太地区频繁引发手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)疫情,并可引起部分婴幼儿重症表现甚至死亡。为了阐明EV71-B5亚型在亚太地区的流行病学规律及进化特征,本文采用分子生物学软件(主要包括BioEdit、MEGA 5.0、Jmodeltest2.1.7、BEAST1.8.2、Tracer1.5、FigTree1.4.3、SPREAD1.0.7),对60条亚太地区的EV71-B5亚型序列进行进化分析及系统发育地理学分析。分析结果显示EV71-B5亚型可在同一地区(中国台湾、泰国等)频繁流行,最近共同祖先的起源时间为2000年9月(95%CI:1999年8月~2001年9月),平均进化速度为4.045×10~(-3)(95%CI:3.222×10~(-3)~4.909×10~(-3));此外,迁移图谱表明EV71-B5亚型在亚太地区具有明显的迁移传播现象,中国厦门EV71-B5亚型分离株(JN964686)推测来源于新加坡地区(BF=3.17)。这种现象提示我国需要加强对该亚型的监测力度,以免发生大范围暴发。     

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

EV71 3C蛋白酶与ZMYM2相互作用及功能初探

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属A组病毒的代表株,感染可引发手足口病(Hand-foot and mouth disease,HFMD),严重危害儿童健康.EV71 3C蛋白酶(3C)是其编码的主要蛋白酶之一,在病毒多蛋白加工过程中发挥关键作用,同时切割细胞蛋白以利于病毒复制.为进一步了解EV71与宿主间博弈关系,本课题组前期以3C为诱饵进行酵母双杂交实验,筛选与3C发生相互作用的可能底物,钓取到锌指MYM型蛋白2(Zinc finger MYM-type protein 2,ZMYM2).ZMYM2是一种具有锌指结构的转录因子,与细胞中重要的抗病毒小体PML核体(PML nuclear bodies,PML-NBs)的形成及稳定性相关.本文选择3C与ZMYM2关系展开研究,确证二者相互作用并初探生物学功能.首先通过免疫共沉淀实验确证3C与ZMYM2之间存在相互作用;随后分析功能,发现过表达ZMYM2抑制EV71复制;敲减内源ZMYM2有利于EV71的复制;分析3C对ZMYM2影响,发现3C剂量依赖性切割ZMYM2,ZMYM2上至少具有2个3C的识别位点.本研究为解析ZMYM2功能及进一步了解EV71与宿主先天免疫间博弈关系提供了新的实验证据.     

2008～2011年贵州省肠道病毒71型分子流行特征分析

为研究贵州省肠道病毒71型(EV71)的基因型和分子流行特征,监测了全省报告的手足口病病例,选择2008年以来贵州全省部分EV71阳性标本进行病毒分离及VP1全基因测序(含重症病例、死亡病例和轻症病例),与国内外近年流行毒株及各亚型代表株进行基因比对,分析同源性及基因亚型。2008年、2009年及2011年贵州省流行的主要病原为EV71,获得109株参比序列毒株的同源性为95.3%～99.7%,贵州省毒株与邻省及山东省、上海市、南京市、吉林省和宁波市代表株的同源性最高,轻症与重死病例的核苷酸及氨基酸序列无明显的特征性差异,未出现不同基因亚型病毒的输入或改变,仍属C4a亚型。同地区、同年度内的核苷酸序列差异小于跨地区、跨年度差异。     

肠道病毒71型(EV-A71)感染ICR小鼠模型的建立

为研究肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)经不同攻毒方式感染不同日龄ICR乳鼠的感染情况,了解EV-A71在小鼠体内的动态分布和感染机制,为建立EV-A71感染动物模型,本研究采用分离自重症手足口患儿的EV-A71毒株,分别通过肌肉注射(Intramuscular injection,IM)、腹腔注射(Intraperitoneal injection,IP)以及脑内注射(Intracerebral injection,IC)的方式感染3日、5日和9日龄ICR乳鼠,感染后定期采集血液和各组织,通过Realtime PCR追踪各组织中病毒载量变化,并且通过切片制作和免疫组化对感染乳鼠进行病原学和病理学分析。结果显示:对于低日龄(≤5日龄)乳鼠,注射剂量在104.5 TCID50/g·体重时IM、IP及IC均为较好的感染方式,都会出现神经症状,且有极高的致死率。随着日龄增长,感染后症状有所减轻,但IM和IP感染途径对大日龄乳鼠仍具有良好的致病性,且IM和IP死亡率显著高于IC死亡率。经IM、IP和IC注射感染病毒的3日龄乳鼠在6dpi体重相对于各对照组分别下降了1.54g(31.43%)、1.31g(15.06%)和2.52g(44.28%),而经IM和IP感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于各对照组分别下降了0.605g(8.95%)、0.886g(15.51%),经IC感染的5日龄乳鼠6dpi体重相对于对照组上升了0.904g(14.70%),感染组体重均显著低于对应的同期对照组(P0.05)。经IM、IP和IC感染病毒的3日龄乳鼠9dpi均死亡,而5日龄乳鼠9dpi存活率分别为42.8%、25%和87.5,14dpi存活率分别为0%、0%和25%,9日龄乳鼠9dpi存活率分别为70%、84.62%和100%。病理学及免疫组化检查显示EV-A71病毒具有强烈的嗜神经性及嗜骨骼肌的特性,可导致病毒血症、脑神经元及骨骼肌坏死、心肌间质水肿及多脏器炎症反应。我们系统地研究了不同攻毒方式感染不同日龄的ICR乳鼠后的病毒动态分布及免疫病理损伤,发现经肌肉注射或腹腔注射5日龄乳鼠能够建立理想的EV-A71感染动物模型。     

TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系研究

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)是5岁以下婴幼儿常见的病毒性肠道传染病,该病主要由人肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)型及柯萨奇A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)引起,但关于TLR3、TLR4基因多态性与EV71感染手足口病的报道较少。为探讨EV71感染手足口病患儿TLR3和TLR4基因多态性与EV71感染手足口病严重性及易感性的关系,本研究选择2016年8月至2017年8月就诊于安徽医科大学第一附属医院的EV71感染手足口病患儿166例,其中重症组76例,轻症组90例,并选择同期来院体检的健康者120例作为对照组。收集患者入院时的年龄、性别、发热天数等基线资料,采集血液检测白细胞计数(White blood cell count,WBC)、丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Glutamate transaminase,AST)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)水平;分离外周血单个核细胞提取DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA情况;聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增TLR3c.1377C/T和TLR4-896A/G,限制性内切酶Tap I(TthHB8 I)、Nco I分别酶切TLR3、TLR4 PCR扩增产物,凝胶成像系统记录实验结果,对扩增产物进行测序,分析其基因多态性结果。结果显示,对照组与EV71感染组TLR3c.1377C/T位点的基因型分布与C、T等位基因频率均无显著统计学意义(P0.05);EV71感染组中重症组TT基因型较轻症组显著升高(P0.05);重症组T等位基因频率显著高于轻症组(P0.05),C等位基因频率显著低于轻症组(P0.05);EV71感染组中,TLR3c.1377C/T位点不同基因型患儿在年龄、性别及ALT、AST、CKMB水平上无显著差异(P0.05);TLR3c.1377C/T位点TT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CT和CC型,CT型患儿的发热时间及WBC、CRP水平显著高于CC型(P0.05);CC型患儿的IFN-γ水平显著高于CT和TT型(P0.05);TLR4-896A/G基因电泳条带为140bp的特异性扩增产物,为野生型Asp/Asp基因型,对照组和EV71感染组均未出现A→G的突变。本研究得出结论,TLR3c.1377C/T位点有CC、TT、CT三个基因型,且携带T等位基因EV71感染手足口病患儿进展为重症的风险较高;TLR4-896A/G基因无突变,与EV71感染手足口病患儿疾病严重性和易感性无关。     

全球EV-A71的基因型分布

肠道病毒A组71型(EV-A71)是引起手足口病暴发流行的主要病原体,也是除脊髓灰质炎病毒以外最为重要的人肠道病毒病原体。截止2017年2月,全球报道的EV-A71共包括7个基因型(A~G)和14个基因亚型,其中B基因型和C基因型是目前全球流行的优势基因型,目前已鉴定B基因型有8个基因亚型(B0~B7),C基因型有6个基因亚型(C1~C6)。C4基因亚型中C4a进化分支是引起中国大陆近年手足口病大规模暴发流行的主要病原之一,也是引起手足口病重症和死亡的绝对优势病原体。本文对全球流行的EV-A71基因(亚)型的地理和年代分布、新基因型的发现进行了系统的归纳分析,为中国检测和监测引起HFMD流行的EV-A71基因型或亚型的动态变化提供基础数据。     

柯萨奇病毒A组16型研究进展

柯萨奇病毒A组16型(CA16)是引起手足口病(HFMD)的主要病原体,与肠道病毒71型(EV71)交替或共同流行;特别是近年在西太平洋地区呈现流行强度高、重症和死亡人数多的特点,已成为该地区的重大公共卫生问题。研发安全有效的疫苗是控制HFMD流行的有效手段。由于EV71所致疾病在重症和死亡病例中所占比例高,对其疫苗研发得到了广泛关注,全病毒灭活疫苗已进入III期临床,有望即将应用于婴幼儿HFMD的防控。EV71疫苗的顺利研发随之也增加了对CA16疫苗研发的迫切性。近年来日本、新加坡以及中国台湾地区逐渐开始关注CA16相关的研究,我国也有多家企业开展CA16疫苗的研发。本文就CA16的病原学,流行病学,实验室诊断,治疗和预防等方面进行了综述。     

肠道病毒A71型致人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B凋亡和S期阻滞的研究

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)是手足口病的重要病原体,为研究EV-A71感染人扁桃体上皮细胞后对细胞凋亡和细胞周期的影响,确定ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)的作用,本文以人扁桃体上皮细胞系UT-SCC-60B为细胞模型,CCK-8试剂盒检测EV-A71对UT-SCC-60B的抑制率、流式细胞仪检测EV-A71感染组和抑制剂处理组的凋亡和细胞周期、Caspase活力检测试剂盒测定Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。EV-A71以感染剂量和感染时间依赖方式抑制UT-SCC-60B增殖;EV-A71感染致UT-SCC-60B发生细胞凋亡,抑制ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt能够降低UT-SCC-60B细胞凋亡比例;EV-A71感染UT-SCC-60B后发生S期阻滞,抑制ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase阻止UT-SCC-60B发生S期阻滞;EV-A71感染UT-SCC-60B能够活化Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9且ERK1/2、JNK1/2和PI3K/Akt调控Caspase-3,Caspase-8,Caspase-9活力。因此,EV-A71能够导致人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B发生凋亡和S期阻滞,并且ERK1/2、JNK1/2、PI3K/Akt和Caspase参与凋亡和S期阻滞的调控。