丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

丙型肝炎病毒核心抗原高效表达及产物抗原性的研究

用含谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）基因的ｐＧｅｘ－２Ｔ为表达载体在大肠杆菌中高效表达了含ＨＣＶ核心区部分基因片段（约１２２个氢基酸）的融合蛋白,表达产物Ｃ２７经测定占菌体总蛋白的３０％,Ｃ２７纯化后,用我国ＨＣＶ诊断试剂第二代血清参考品为标准与Ｇ１１核心抗原进行比较,结果显示二者具有相同的总体检出率和近似的抗原活性。因此,推测表达的部分区段基因可能是核心区重要功能区域。另外融合蛋白对提高重组蛋白的抗原活性和分离纯化等均有一定作用。     

丙型肝炎病毒多表位抗原基因的构建与免疫原性研究

丙型肝炎病毒(HCV)基因易发生变异, 尤其是含中和抗原表位的高变区1(HVR1)变异性最大. 模拟HVR1的B细胞表位具有涵盖多种天然表位的抗原特性, 保守的T细胞表位具有各型间的相对保守性. 为解决HCV高变性造成的疫苗研究障碍, 我们选取HCV E2区HVR1(384～410 aa)模拟B细胞表位9条、C区的保守CTL表位2条(35～44 aa, 132～140 aa)、NS3区保守的CTL表位1条(1073～1081 aa)及NS3区保守的Th表位1条(aa 1251～1259), 各表位之间以插入3个氨基酸为连接臂, 人工合成上述13条表位基因串联的HCV多表位抗原基因(mfc). 将mfc与gst基因融合, 表达了多表位抗原蛋白GST-MFC. 同时, 构建了白介素-2信号肽基因、PADRE表位基因和mfc基因串联的候选HCV DNA疫苗, 即质粒pVAX1.0-st-mfc. 以GST-MFC蛋白免疫家兔和质粒pVAX1.0-st-mfc免疫小鼠, 采用ELISA和Western blot方法, 应用10条具有代表性的HCV HVR1合成肽进行检测, 证明有9条HVR1合成肽能与所有免疫动物血清反应, 交叉反应率(cross reactivity, CR)为90%. 应用HCV抗体阳性的感染者血清与多表位抗原GST-MFC蛋白进行反应, 证明其反应识别率(reactivity frequency, RF)为75%. 上述结果表明, 筛选合成的HCV多表位抗原基因mfc具有HCV中和抗原表位的特征, 可作为HCV疫苗研制的候选基因.     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

丙型肝炎病毒非结构3区基因片段的克隆表达及抗原纯化鉴定

通过逆转录ＰＣＲ技术,从中国江苏省丙型肝炎病人血清中扩增克隆了丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的非结构３区的部分基因片段（Ｃ３３）。ＤＮＡ序列分析证实,该片段全长８４２ｂｐ。在合成的一对逆转录ＰＣＲ引物上,上游引物增加了ＮｃｏⅠ酶切位点（内含起始密码子ＡＴＧ）,下游引物上增加了ＳａｌⅠ酶切位点及终止密码子ＴＡＡ,将克隆的Ｃ３３基因片段克隆至表达载体ｐＢＶ２２１内,获得了表达Ｃ３３抗原的工程菌,表达Ｃ３３抗原分子过为３０ｋＤ,经尿素裂解纯化、分子筛分离纯化及复性后进行离子交换和反相亲和层析纯化,获得的重组蛋白经ＥＬＢＡ和免疫印迹等证实有较好的抗原性和特异性。     

丙型肝炎病毒基因分型研究状况

当前HCV基因分型研究十分活跃,但由于在基因分型的方法,命名等方面尚不统一,所以各国学报道的分型结果很不一致,本对近来HCV基因分型的现状,存在的问题及开展HCV基因型研究的意义进行了综述。     

利用合成肽进行丙型肝炎病毒（HCV）的线性抗原表位分析

首先利用固相多肽合成技术对ＨＣＶ多蛋白中可能含有优势抗原表位的１４个肽段进行了化学合成,并用合成肽作包被抗原进行间接ＥＬＬＳＡ试验来分析它们的抗原性,结果表明,所有合成肽中除ＮＳ３区的Ｐ７、Ｐ８和ＮＳ５区的Ｐ１３无抗原性外,其余肽段均具有抗原活性,其中Ｃ区的Ｐ１,ＮＳ４区和Ｐ９和ＮＳ５区的Ｐ１２三个肽段的抗原性较好,与相应的重组蛋白Ｃ２２,Ｃ１００和ＮＳ５Ａ比较,它们之间的抗原性比较接近,随后选择抗原性较好的几个肽段合成了含八分支的多抗原肽（ＭＡＰ）ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ１０和嵌合多肽ＣＰ１５等工程肽抗原,前者不仅保持了相应单体肽的抗原性,而且与抗体反应的敏感性有显著提高;后者含双表位改善了常规合成肽抗原表位单一的缺陷,为研究ＨＣＶ工程肽抗原进行了有益的尝试。     

ELISA in serodiagnosis of HCV infection

Abstract: A high level of anti-HCV is generally associated with viral replication and the number of recognized epitopes appears to be correlated with the viral charge. Nevertheless, the absence of detectable antibodies in about 60% of patients during the acute phase of the disease adn in 10% of chronically infected (generally immunocompromised subjects) are heavy handicaps for HCV serology. Moreover, low levels of anti-HCV antibodies can persist after complete recovery, and HCV viremia does not appear to be associated with the presence of a special antibody specificity. The immunoblots presented as 'confirmatory test' always appear to be less sensitive that the screening tests adn therefore are unable to discriminate between post-infection antibodies and false-positive reactions, as rare as they can be. In these cases, as in non-responder patients, PCR appears essential. The possible reasons of immune response limitations and the possible improvements of HCV serology are discussed.     

丙型肝炎病毒多表位DNA疫苗的研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是非甲非乙型肝炎的主要病原,目前还没有有效的预防和治疗手段。多表位DNA疫苗(multi-epitope DNA vaccine, minigenes/epigenes)是指通过筛选与组合优势抗原表位(包括T细胞、B细胞表位)基因,以能产生高效细胞、体液免疫应答进而清除HCV病毒为目的的新型核酸疫苗。其优势在于通过选择最具免疫保护潜力的表位以覆盖尽量多的病毒亚型和诱导全面的机体抗病毒免疫应答,并尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响。本文介绍近年来国内外在丙型肝炎多表位DNA疫苗方面的研究进展,并展望了其发展方向。     

戊肝与丙肝病毒在献血员人群中感染状况的对比研究

采用市售试剂对武汉地区乡村献血员进行血清抗ＨＥＶ与抗ＨＣＶ检测,两者的阳性率分别为５．７４％及９．３５％。在２８８份有ＡＬＴ记录的单采浆献血员中,有近期ＡＬＴ升高史的献浆者抗ＨＥＶ及抗ＨＣＶ检出率分别为１４．０４％及１４．１８％,均显著高于无近期ＡＬＴ升高史的献浆者。对上述标本同时进行多项血清ＨＢＶ标志检测,抗ＨＥＶ阳性及抗ＨＣＶ阳性组献血员多项ＨＢＶ标志检测结果与相应阴性组比较均未见显著的差别。     

PCR－ELISA在检测血清中丙型肝炎病毒上的应用

建立了一个替代目前使用的套式ＰＣＲ的血清中丙型肝炎病毒ＲＮＡ检测的新方法。该方法只需经过一次ＰＣＲ扩增,即可通过对掺入标记物的ＰＣＲ产物的ＥＬＩＳＡ检测得到与套式ＰＣＲ相同的结果。与套式ＰＣＲ相比,该方法具有耗时少、易操作、较少产生假阳性等特点。     

Th1类细胞因子对pHCV—C重组体诱生免疫应答的增强作用

为了探索Th1类细胞因子IL 2和IL 12对含丙型肝炎病毒 (HCV)核心 (C)基因重组体诱生的免疫应答的增强作用 ,本文构建了包含HCVC基因片段的重组质粒pHCV C ,将其单独或与Th1类细胞因子表达质粒 pIL 2或pIL 12共免疫BALB/c小鼠 ,ELISA法检测免疫小鼠血清中的HCVC特异性抗体滴度 ;以pHCV C转染SP2 / 0细胞 ,经筛选稳定表达HCVC抗原者 (SP2 / 0 HCV C)为靶细胞 ,51Cr释放试验检测细胞毒T淋巴细胞 (CTLs)的体外特异性杀伤功能。结果发现 ,pIL 2能够增加 pHCV C诱导的抗体产生 ,对CTLs的杀伤作用增强却不明显 ;而 pIL 12对 pHCV C诱导的抗体和细胞免疫应答均有增强作用 (p <0 .0 5 )。由此推断 ,佐以Th1类细胞因子 ,不仅可以增强基因疫苗诱生的免疫应答强度 ,而且可能使机体对基因疫苗的免疫应答朝着有利于优先诱导CTLs免疫应答清除病原体的方向发展。     

HCV Antibody Response and Genotype Distribution in Different Areas and Races of China

Hepatitis C virus (HCV) heterogeneity accounts for the failure of effective vaccine development and the lack of successful anti-viral therapy in some patients. Little is known about the immune response to HCV peptides and the region or race specific genotypes in China. The objective of this study was to characterize HCV antibody immune response to HCV peptides and HCV genotypes in different regions and races of China. A total of 363 serum samples were collected from HCV carriers in 6 regions in China. The immune response to HCV peptides was evaluated by ELISA. HCV genotypes were examined using nested RT-PCR. We found that the anti-HCV antibody neutralization rates were significantly different among the serum samples from different areas or from different races in the same area. For samples from Tibet and Sinkiang, the rates of neutralization by HCV peptides were only 3.2% and 30.8%, respectively. The genotypes of samples from Tibet and Sinkiang were apparently heterogeneic and included type I, II, III and multiple types (I/II/III, I/II, I/III, II/III). One specific sample with multiple-genotype (I/II/III) HCV infection was found to consist of type I, II, III, II/III and an unclassified genotype. These studies indicate that the anti-HCV antibody immune response to HCV peptides varied across regions and among races. The distribution of HCV genotypes among Tibetans in Tibet and Uighurs in Sinkiang was different from that in the inner areas of China. In addition, a “master” genotype, type II, was found to exist in HCV infection with multiple HCV genotypes.