表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒的构建和鉴定

在克隆和鉴定新城疫病毒（NDV）F48E8株血凝素－神经氨酸酶（HN）基因的基础上,应用分子克隆技术将HN基因导入鸡痘病毒插入载体pFG1175－1中启动子P7．5的下游,得到携带NDV-HN基因的质粒pFGHN1175－1。将此质粒pFGHN1175－1以脂质体转染中国鸡痘病毒疫苗株282E4株感染3～4h的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化3次,得到稳定的重组鸡痘病毒。用NDV—HN基因特异性探针进行斑点杂交试验以及用HN基因特异性引物作PCR检测,表明NDV—HN基因已插入鸡痘病毒基因组中。以NDV－HN蛋白特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验,证实重组鸡痘病毒在感染细胞中表达了HN糖蛋白,从而成功建立了表达新城疫病毒F48E8株血凝素-神经氨酸酶的重组鸡痘病毒。     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RTPCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P75的下游,得到重组转移载体1175HA。以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wtFPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含Xgal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPVHA。以间接免疫荧光法证实感染rFPVHA的CEF表达了HA。rFPVHA在免疫7日龄SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天。在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPVＨＶ能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

共表达H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒（流感）的基因工程疫苗,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素（HA）基因、鸡Ⅱ型干扰素（IFN－Ⅱ）全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE／L）的基因片段,定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到HA和IFN－Ⅱ基因分别处于P7．5及PE／L转录调控下的重组转移载体1175HAIFN。以脂质体转染法将1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中。1175HAIFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-HA-IFN-Ⅱ。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀获得并纯化rFPV-HA-IFN-Ⅱ。以间接免疫[荧光法和细胞病变抑制试验证实,纯化的rFPV-HA-IFN-Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗HSV活性的鸡IFN－Ⅱ。动物试验表明,rFPV-HA-IFN-Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒（rFPV-HA)抑制日龄SPF雏鸡增重的副作用。     

鸡痘病毒复制非必需区的选择对重组鸡痘病毒免疫效力的影响

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体疫苗至今未能得到大规模推广应用的主要原因,而选择适当的FPV复制非必需区可能是解决这一问题的方法之一。根据已发表的美国致病株FPV的基因组设计两对引物,用PCR方法扩增FPV假定复制非必需区的两个侧翼区FPV1和FPV2 ,利用此假定复制非必需区构建FPV表达载体pP12LS及表达ZJ1株新城疫病毒(NDV)F基因的转移载体pP12LSF。pP12LSF与2 82E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF) ,经数轮蓝斑筛选得到纯化的重组病毒rFPV_FSC。重组FPV在CEF上连续传2 0代仍具有良好的遗传稳定性。对重组FPV进行免疫效力试验,在SPF鸡上,重组病毒rFPV_FSC和与之仅有复制非必需区差异的rFPV_FSB均能抵抗NDV强毒的攻击,提供10 0 %的保护。但在有母源抗体的商品鸡上,rFPV_FSC与rFPV_FSB的免疫效力却有显著差异,保护率分别为10 0 %和6 1 5 4 % ,rFPV_FSC的免疫效力与NDV常规油苗相当。试验结果表明,母源抗体对重组FPV的免疫效力有一定的影响,而选择合适的FPV复制非必需区是克服母源抗体并提高重组FPV免疫效力的有效策略之一     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。     

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0.用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0.PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达.重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1∶4 096.重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础.     

表达H9亚型禽流感流毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力

以RT－PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒（AIV）分离株（A／Chicken/China/F/1998)的血凝素（HA）基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7．5的下游,得到重组转移载体1175HA,以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞（CEF）中,通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA,以间接免疫荧光法证实感染rFPV-HA的CEF表达了HA,rFPV-HA在免疫7日SPF鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制（HI）抗体,14天后诱生的HI抗体能达到高峰,且诱生的HI抗体保护较高水平达55天,在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行了免疫效力试验表明,rPV-HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ_干扰素(ChIFN_γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1_ChIFN_γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN_γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid_ChIFN_γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ_干扰素（rChIFN_γ）的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞（CEF）的细胞病变抑制试验,检测rChIFN_γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN_γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN_γ基因表达产物的活性最高,达到10.6～10 7.2U/mL。 以rChIFN_γ进行对新城疫病毒(NDV) F48E8株、禽流感H5N1病毒（AIV_H5）和马立克氏病病毒 (MDV) GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN_γ对AIV_H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDV F48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

重组鸡γ_干扰素在昆虫细胞中的高效表达

将鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)基因克隆到载体pFASTBAC1中,构建转移载体pFASTBAC1-ChIFN-γ,然后转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座,将ChIFN-γ基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建表达质粒Bacmid-ChIFN-γ;通过脂质体将表达质粒转染Sf9昆虫细胞,用间接免疫荧光试验鉴定重组鸡γ-干扰素(rChIFN-γ)的表达;通过水泡性口炎病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞病变抑制试验,检测rChIFN-γ的活性。研究结果表明,感染重组杆状病毒的Sf9细胞能高效表达rChIFN-γ,且当每个细胞的感染量为1个病毒时,细胞在感染96h后,rChIFN-γ基因表达产物的活性最高,达到106~107.2U/mL。以rChIFN-γ进行对新城疫病毒(NDV)F48E8株、禽流感H5N1病毒(AIV-H5)和马立克氏病病毒(MDV)GA株的抗病毒活性试验,发现rChIFN-γ对AIV-H5和MDV GA株病毒有明显的抑制其致细胞病变作用,但对NDVF48E8株病毒在体外不能抑制其致细胞病变作用,仅能在病毒滴度上表现抑制效果。     

Virus Replication in Enucleate Cells: Vesicular Stomatitis Virus and Influenza Virus

The requirement of the presence of a nucleus for the replication of vesicular stomatitis virus and influenza virus has been examined by following the growth and development of these viruses in enucleate BS-C-1 cells. Vesicular stomatitis virus replicates normally in enucleate cells with the rate of production of infectious virus, the amount of virus-specific protein synthesis, and the type of proteins produced being essentially the same in nucleate and enucleate cells. Influenza virus does not replicate in enucleate cells, no virus gene products can be detected, and there is no inhibition of cellular protein synthesis.     

Infective Virus Substructure from Vesicular Stomatitis Virus

Treatment of suspensions of vesicular stomatitis virus with Tween-ether results in a rapid and considerable loss of infectivity (ca. 4 logs in 2 min), but the residual infectivity is comparatively stable to further treatment with ether. The infectivity remaining after the short exposure to Tween-ether is not due to virus for the following reasons. (i) It is much less infective for tissue cultures than for mice, whereas the intact virion is equally infective for both hosts. (ii) The residual infectivity is much less stable than virus infectivity in both sucrose and tartrate gradients. (iii) Virus immune serum does not neutralize its activity. (iv) The infectivity is associated with material which sediments further in sucrose gradients and has a greater buoyant density in tartrate gradients than the virion. Experiments with (32)P-labeled virion showed that the infective substructure contains ribonucleic acid with the same sedimentation characteristics as that extracted from the virion. Electron microscopy shows that the infective component has the same overall bullet-like structure as the virion but lacks the outer envelope and fringe structure.     

肝炎病毒与EB病毒重叠感染

为探讨肝炎病毒（ＨＶ）与ＥＢ病毒（ＥＢＶ）重叠感染的状况和后果,我们用免疫酶法对１５４例各型病毒性肝炎患者作了ＥＢＶＩｇＡ抗体检测。结果发现,急性肝炎、慢性轻度肝炎、慢性中度肝炎、肝炎肝硬化、慢性重型肝炎和原发性肝癌ＶＧＡ－ＩｇＡ抗体的阳性率分别为２４．０％、３０．０％、５３．３％、６３．３％、４０．０％和７２．７％,与健康人（５．３％）比较,有非常显著升高（Ｐ＜０．０１）;原发性肝癌又较急性肝炎和慢性轻度肝炎高,并有非常显著意义差异（Ｐ＜０．０１）。ＨＢＶ和ＨＡＶ＋ＨＢＶ感染者比较,前者又较后者低（Ｐ＜０．０１）。重叠感染者的临床表现均为“肝炎型”,未见咽炎、腺热、胃肠、肺炎、肾炎、神经等类型。重叠感染者的ＣＤ＋３及ＣＤ＋４Ｔ细胞下降,ＣＤ＋８Ｔ细胞及ＩｇＧ,ＩｇＭ升高,与健康人比较差异非常显著意义（Ｐ＜０．０１）。结果提示：ＨＶ感染,不仅因免疫失调易感ＥＢＶ,又可因重叠感染而进一步使免疫功能失调;对病毒性肝炎的处理应强调免疫调节治疗。     

人呼吸道合胞病毒活疫苗研究进展

人呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿支气管炎和肺炎的主要原因,也可导致免疫缺陷病人及老年人群显著发病和死亡.人呼吸道合胞病毒疫苗已被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)列为全球最优先发展的疫苗之一.经过50多年的研究,尤其是随着重组技术和反向遗传学的出现,对RSV疫苗的研究取得了重要进展,...     

Infectious Rous Sarcoma Virus and Reticuloendotheliosis Virus DNAs

An efficient and quantitative assay for infectious Rous sarcoma virus and reticuloendotheliosis virus DNAs is described. The specific infectivities of viral DNA corresponded to one infectious unit per 10(5) to 10(6) viral DNA molecules. Infection with viral DNA followed one-hit kinetics. The minimal size of infectious Rous sarcoma virus DNA was approximately 6 million daltons, whereas the minimal size of infectious reticuloendotheliosis virus DNA was larger, 10 to 20 million daltons.